上海临港地区猪源ETEC毒力因子及耐药性调查

邢 涛，郁星星，朱爱军，张红飞，周光胜，张 敏，王海根，李金贵

（1.上海闵行区动物疫病预防控制中心，上海 201109；2.上海浦东新区农业服务中心南汇新城站，上海201303；3.上海浦东新区农业服务中心书院站，上海 201304；4.江苏省扬州大学兽医学院，扬州 225009）

上海临港地区猪源ETEC毒力因子及耐药性调查

邢 涛1，郁星星2，朱爱军3，张红飞1，周光胜1，张 敏1，王海根1，李金贵4

（1.上海闵行区动物疫病预防控制中心，上海 201109；2.上海浦东新区农业服务中心南汇新城站，上海201303；3.上海浦东新区农业服务中心书院站，上海 201304；4.江苏省扬州大学兽医学院，扬州 225009）

为了解上海市畜源产肠毒素大肠杆菌（Enterotoxigenic E.coli，ETEC）的携带情况和耐药性本底数据，对上海市临港区域内致仔猪腹泻病原进行多重PCR鉴定以及药物敏感试验。结果显示，从上海市临港地区不同猪场240份样品中分离得到3株ETEC，检出率为1.25%。PCR结果表明成功分离到2株ST2型ETEC，1株LT1+ST2型ETEC，且其菌毛基因型均为F18ac。耐药性分析表明，这3株细菌均对羧苄青霉素敏感，对呋喃妥因、左氧氟沙星中度敏感，对庆大霉素、四环素耐药，对氨苄西林、恩诺沙星、多黏菌素B因菌株不同存在差异。结果表明上海市临港地区猪群中确实存在高耐药性ETEC，建议加强对ETEC的监控。

产肠毒素大肠杆菌；毒力因子；耐药性；腹泻；仔猪

产肠毒素大肠杆菌（EnterotoxigenicE.coli，ETEC）是一类致人和幼畜（初生仔猪、犊牛、羔羊及断奶仔猪）腹泻最常见的病原菌之一，由黏附素和肠毒素共同作用而成[1,2]。畜类携带以及畜源食品中污染的这类病原菌甚至是耐药ETEC已成为威胁食品安全的重要风险因素[3]。令人更为担忧的是，动物源性食品中污染的ETEC致病菌不仅严重危害人类健康，而且养殖场滥用药物会导致耐药性ETEC的大量产生和广泛传播，这些耐药菌通过生产链最终污染产品，使得食源性细菌疾病的防控和治疗更加困难[4]。

上海市临港地区畜类养殖场中ETEC的携带状况及耐药性尚未见相关调查报道，已严重影响到有关部门对于食品安全防控措施的研究和制定，摸清ETEC在临港地区畜产品中的流行状况及耐药性情况，显得格外重要与紧迫。本研究利用多重PCR诊断方法，对临港地区致仔猪腹泻ETEC毒力因子（肠毒素及黏附素）进行PCR基因型鉴定，并利用药敏试验进行相关耐药性研究，可以初步掌握该地区畜产品中ETEC的携带情况及耐药性数据，为制定详细的控制动物源性食品污染技术提供理论支持，为防控食源性细菌疾病ETEC提供新思路。

1 材料与方法

1.1 病料 2015～2016年在上海市临港地区3个当地规模养猪场，无菌采集1～50日龄腹泻仔猪粪便样品共240份。取上述粪便少许，采用EMB培养基分离纯化大肠杆菌，对分离菌进行大肠杆菌生化指标特性鉴定。对于符合大肠杆菌基本特征的分离菌，用LB液体培养基增菌，37℃培养12 h，备用[5]。

1.2 主要试剂 PCR试剂盒、DNA Marker DL2000购自大连宝生物工程有限公司；琼脂糖购自TaKaRa公司；检测ETEC肠毒素（LT1、ST1、ST2）和黏附素（K88、K99、987P、F41、F18）特异性扩增引物由上海生工生物工程有限公司合成；药敏纸片购自Oxoid公司。

1.3 引物设计 根据文献[6-8]中的研究方法设计并合成ETEC肠毒素以及黏附素9对特异性引物，引物序列见表1、2。

表1 ETEC肠毒素扩增引物序列Table 1 ETEC enterotoxins ampli fi cation primers sequences

表2 ETEC黏附素扩增引物序列Table 2 ETEC adhesins ampli fi cation primers sequences

1.4 多重PCR鉴定 采用酚-氯仿抽提法提取细菌基因组作为ETEC多重PCR的反应模板，参考文献[9]中PCR方法并进行优化，对ETEC肠毒素基因型进行鉴定，并以引物K88、987P、F41、K99、F18进行ETEC黏附素基因型鉴定。

1.5 药敏试验及临床治疗 取分离鉴定的ETEC，选用常用的药敏纸片进行药物敏感性测定，根据美国临床和实验室标准化研究所（clinical laboratory standards institute，CLSI）制定的M100-S27文件推荐方法作为抗菌药物敏感性的判定标准[10]。选用的药敏纸片包括：羧 青霉素、氨 西林、头孢拉定、头孢曲松、左氧氟沙星、恩诺沙星、诺氟沙星、庆大霉素、链霉素、阿米卡星、四环素、强力霉素、多黏菌素B、杆菌肽、呋喃妥因、呋喃唑酮等。选择敏感药物用于临港地区猪场腹泻仔猪的临床治疗，每天2次。

2 结果

2.1 PCR鉴定结果 采用经优化过的多重PCR方法对ETEC能扩增出特异性片段，其中，ST2型ETEC的条带约为282 bp；LT1型ETEC的条带约为360 bp；F18ac菌毛型的条带为520 bp（图1，2）。对240份猪场粪便样品选择性培养，进行PCR鉴定，结果获得3株相应的ETEC，其中2株为ST2型，1株为LT1+ST2型，检出率为1.25%，分别命名为ETEC01、ETEC02、ETEC03。3株ETEC的菌毛均为F18ac型，未发现其他菌毛型细菌。

图1 ETEC肠毒素基因PCR结果Fig.1 PCR of enterotoxin genes in the ETEC isolates

图2 ETEC菌毛基因PCR结果Fig.2 PCR of fi mbriae genes in the ETEC isolates

2.2 药敏试验

2.2.1 抗菌药物敏感性 根据CLSI的判断标准，将细菌对抗菌药物敏感性划分为敏感（susceptible，S）、中介（intermediate，I）和耐药（resistant，R）三类，药物敏感性排序结果见表3。由表3可知，药物敏感性排名前3位的抗生素为羧 青霉素、氨 西林和杆菌肽。耐药性分析结果表明，上海市临港地区分离的3株ETEC均对羧 青霉素敏感；对呋喃妥因、左氧氟沙星中度敏感；对头孢拉定、头孢曲松、庆大霉素、链霉素、阿米卡星、四环素耐药，对氨 西林、杆菌肽、多黏菌素B、恩诺沙星、呋喃唑酮、诺氟沙星、强力霉素因菌株不同也有差异。

2.2.2 多重耐药性与耐药谱 根据药敏试验测定结果对上海临港地区分离的3株产肠毒素大肠杆菌进行多重耐药性分析，本研究中ETEC的主要耐药谱型有6种：分别是头孢拉定（CED）、头孢曲松（CRO）、庆大霉素（GEN）、链霉素（STR）、阿米卡星（AMK）、四环素（TET），其中ETEC03耐7种药物，ETEC02耐8种药物，ETEC01耐受药物最多，可同时耐受10种药物，结果见图3。

2.2.3 临床治疗效果 通过上述分离菌株的耐药性分析，对临港地区腹泻仔猪选用羧 青霉素进行肌肉注射治疗，适当补液，同时采取加强饲养管理、科学消毒以及减少应激等综合措施，结果发现猪场发病仔猪于治疗后3～4 d停止腹泻，以后逐渐平稳，d6发病猪群基本恢复正常。

表3 产肠毒素大肠杆菌分离株药物敏感性测定Table 3 The sensitivity of the ETEC isolates to antibiotics

3 讨论

美国农业部最近连续监测报告表明，腹泻仍然主要危害着全球养猪生产，导致猪群中发病率和病死率最高，而ETEC是引起幼龄动物腹泻的主要病原菌，初生幼畜被ETEC感染后常因剧烈水样腹泻所致脱水而死亡[11]，发病率和死亡率均很高，如仔猪黄痢。更为严重的是，畜类携带以及畜源食品中污染的ETEC已成为威胁食品安全的重要风险因子，这些人畜共患致病菌通过生产链最终污染餐桌上的食品，使得食源性细菌疾病的防控愈发困难[12]，严重威胁人类健康。

腹泻性疾病是世界范围内一个重要的公共卫生问题，尤其在欠发达国家，腹泻每年可引起30～50万名5岁以下儿童的死亡。导致这些婴幼儿腹泻的一个最常见病原是ETEC[13]。感染性腹泻的反复发作，可导致婴幼儿患者生长阻滞和营养不良，进而恶性循环，甚至引发死亡。这类病原菌也一直是西方国家旅行者腹泻的最常见病因，常常困扰着被部署在疫区的军事人员。因此，ETEC所引发的一系列感染危害已最终演变成一个重要的公共卫生问题[14]。

图3 产肠毒素大肠杆菌分离株对常用16种抗菌药的耐药谱Fig.3 Drug resistance spectrum of ETEC isolates to commonly used 16 antimicrobial agents

段强德等[15]研究表明，F18ac菌毛常见于ETEC菌体表面，可介导细菌对小肠细胞的黏附，是致断奶仔猪腹泻大肠杆菌ETEC相关2134P、8199、8813菌毛的重要致病毒力因子，其结合到宿主易感上皮细胞是ETEC感染的第一步，也是最重要的关键步骤。成大荣等[16]对江苏省断奶仔猪源ETEC进行分子流行病学调查发现，ETEC 最主要的黏附因子是F18 菌毛，其中F18ab 菌毛占66.49 %；F18ac菌毛占33.33%。本研究分离的3株ETEC菌毛基因型均为F18ac，说明不同地区流行的ETEC菌毛优势基因型是不同的。

蒋磊等[17]报道，引起断奶仔猪腹泻的ETEC与人源ETEC菌株相似，可以表达热敏肠毒素（LT1）或/和热稳定肠毒素（ST2）。本研究分离到的猪源ETEC病原菌肠毒素基因型分别为ST2型（ETEC01、02）和LT1+ST2型（ETEC03），进一步证实猪源ETEC分离株和人源菌株相同，都能表达肠毒素LT1或/和ST2，这可能是独特的宿主受体特异性决定的，这些结果提示猪源ETEC可以提供了解和预防人类感染的重要线索，也为人类ETEC疾病的诊断、预防和治疗开辟一条新途径。

依据CLSI推荐的断点对体外药敏试验结果进行判定，结果表明3株ETEC分离株均具有很强的多重耐药性，最多可同时耐受10种抗菌药物，仅对羧 青霉素敏感。这些耐药性ETEC很有可能通过生猪—猪肉—人的食物链条传递给人类，以人源和猪源相重叠的共生菌为载体，转移耐药性基因[18]对公共健康造成严重威胁。因此，应强化源头治理，加强对上海地区猪场高耐药性ETEC的监控，防止抗生素耐药性畜产品流入市场。

本研究开展的猪源ETEC毒力因子和耐药性本底数据调查有助于我们初步掌握ETEC在上海临港地区畜产品中的流行状况及耐药性情况，可以用于指导临床ETEC感染的预防和治疗。此外，本研究结果还有助于分析畜源ETEC感染程度和毒力风险，可以为食品安全防控政策的研究与制定提供必要的参考依据，对于深入了解ETEC病原菌的致病机理、传播特点和感染强度都具有重要意义[19]。

多年来，抗生素结合大肠杆菌疫苗的高强度使用在一定程度上降低了养殖场断奶仔猪的腹泻率，其功效在于特异性抑制体内已感染的ETEC致病菌，但外界环境污染的大量病原菌得不到有效清除。从分子水平研究ETEC黏附素与易感宿主细胞表面受体结合、相互作用的精确机制，才能高效、特异性封闭或阻断ETEC致病菌与肠道上皮细胞受体的结合，从而开辟出一种非抗生素干预控制ETEC感染的新方法[20]。

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PREVALENCE OF VIRULENCE FACTORS AND ANTIMICROBIAL SUSCEPTIBILITY OF ENTEROTOXIGENIC E.COLI FROM PIGLETS IN LINGANG DISTRICT, SHANGHAI

XING Tao1, YU Xing-xing2, ZHU Ai-jun3, ZHANG Hong-fei1, ZHOU Guang-sheng1, ZHANG Min1,WANG Hai-gen1, LI Jin-gui4

(1.Agriculture Service Centre of Pudong District Nanhui New Town, Shanghai 201303, China; 2.Minhang Center for Animal Disease Control and Prevention, Shanghai 201109, China; 3.Agriculture Service Centre of Pudong District ShuyuanTown, Shanghai 201304,China; 4.College of Veterinary Medicine, Yangzhou University, Yangzhou 225009, China)

The multiple PCR identification and drug susceptible test were applied in order to investigate the prevalence and drug resistance of enterotoxigenic E.coli (ETEC) in piglets in Lingang, Shanghai. Three ETEC isolates were obtained from 240 samples collected from different pig farms and con fi rmed as F18ac positive by PCR. Among three ETEC isolates, 2 isolates were determined to be ST2+and another isolate was LT1+and ST2+. These three ETEC isolates were tested for resistance to seven antibiotics. As a result,all three isolates were highly susceptible to carbenicillin, moderately susceptible to nitrofurantoin and levofloxacin and resistant to gentamicin and tetracycline. The susceptibility of these isolates varied to ampicillin, enro fl oxacin and polymyxin B.

Enterotoxigenic E.coli; virulence factors; antimicrobial resistance; diarrhea; piglet

S858.28

A

1674-6422（2018）01-0055-05

2017-03-07

上海市科技兴农推广项目（沪农科推字(2015)第1-5号）。

邢涛，男，兽医师，主要从事动物疫病防控和临床诊疗

李金贵，E-mail：jgli@yzu.edu.cn