不同环境胁迫因子对猪源耐药大肠杆菌生长的影响

廖书丹 谭艾娟 孙海峰 向润 杨剑 张元鑫 宋旭琴 吕世明

摘要：【目的】探究環境胁迫因子对猪源多重耐药大肠杆菌生存适应性的影响，为创造多重耐药菌株带来高适应代价的环境及加速降低种群耐药水平提供理论依据。【方法】以分离自贵州省规模化猪场的多重耐药大肠杆菌QL15为研究对象，以大肠杆菌质控（敏感）菌株ATCC25922为对照，经体外竞争试验测定不同环境（培养基浓度、碳源、氮源、pH和温度）胁迫下耐药菌株QL15相对于敏感菌株ATCC25922的适应性，并通过重测序变异位点和实时荧光定量PCR测定分析耐药基因表型及外排泵和外膜孔道蛋白基因表达与细菌适应性代价的关系。【结果】耐药菌株QL15在体外独立及混合培养时，除在稀释LB培养基（1/4、1/8和1/16）中的长势较敏感菌株ATCC25922低外，在低碳源（0.1%和0.5%）、低氮源（0.01%和0.05%）、酸碱性（pH=5.0、pH=6.0和pH=8.0）及低温（20 ℃）和高温（42 ℃）胁迫下的生长均优于敏感菌株ATCC25922，且混合培养结果优于独立培养。将耐药菌株QL15基因组序列与敏感菌株ATCC25922基因组序列进行比对，共检测到509个InDel突变位点，其中Delete突变位点233个、Insert突变位点276个;共注释到71个功能基因，以细胞壁与细胞膜相关基因突变最多（10个），占14.1%。与敏感菌株ATCC25922相比，耐药菌株QL15在不同环境胁迫下其外排泵与外膜孔道蛋白相关基因emrB、acrB、tolC和ompC呈下调表达，而ompF基因呈上调表达。【结论】多重耐药大肠杆菌耐药性的获得促使其具有更强的适应性，但对可直接利用营养物质的获取弱于敏感菌株，即处于竞争劣势。耐药大肠杆菌的多重耐药性主要是由多种外排泵和外膜孔道蛋白介导完成，其中，ompF基因在pH胁迫、全营养胁迫和高、低温胁迫下均处于上调表达状态，故推测ompF基因的高表达有利于大肠杆菌在上述胁迫条件下生长。

关键词： 多重耐药大肠杆菌;猪源;环境胁迫因子;相对适应性;耐药性

中图分类号： S852.612                    文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2022）04-0946-12

Effects of different environmental stress factors on the growth of pig-origin drug-resistant Escherichia coli

LIAO Shu-dan1，TAN Ai-juan2，SUN Hai-feng2，XIANG Run2，YANG Jian1，

ZHANG Yuan-xin3，SONG Xu-qin1*，LYU Shi-ming1*

（1College of Animal Science，Guizhou University， Guiyang， Guizhou  550025， China; 2College of Life Sciences，Guizhou University， Guiyang， Guizhou  550025， China; 3 Department of Agriculture and Rural Affairs of

Guizhou Province， Guiyang， Guizhou  550005， China）

Abstract：【Objective】To investigate the effects of environmental stress factors on the survival adaptability of pig-origin multi-drug resistant Escherichia coli， so as to provide a theoretical basis for creating an environment where multi-drug resistant strains could present a high cost of adaptability and for accelerating the reduction of resistance level in the population. 【Method】Multi-drug resistant E. coli QL15 isolated from a large-scale pig farm in Guizhou Province was taken as the study object， and E. coli quality control （sensitive） strain ATCC25922 was taken as the control. The adapta-bility of drug-resistant strain QL15 and that of sensitive strain ATCC25922 under different environmental stress （medium concentration， carbon source， nitrogen source， pH and temperature） was determined by in vitro competition assay. The relationship between drug-resistant gene phenotype and gene expression of efflux pump and outer membrane pore protein with the cost of bacterial adaptation was analyzed by resequencing variant loci and fluorescence quantitative PCR. 【Result】Except that the growth of drug-resistant strain QL15 was lower in dilute LB medium （1/4， 1/8 and 1/16） compared with the sensitive strain ATCC25922， the growth of drug-resistant strain QL15 was better than that of sensitive strain ATCC25922 in in vitro independent and mixed cultures under low carbon sources （0.1% and 0.5%）， low nitrogen sources （0.01% and 0.05%）， acid-base property （pH=5.0， pH=6.0 and pH=8.0）， low and high temperature （20 ℃ and 42 ℃）. Besides， the results of mixed culture were better than that of the independent culture. The genome sequence of drug-resistant strain QL15 was compared with that of sensitive strain ATCC25922， and a total of 509 InDel mutation sites were detected， including 233 delete mutation sites and 276 insert mutation sites; a total of 71 functional genes were annotated， most of which were mutations related to cell wall and cell membrane（10）， accounting for 14.1%. Compared with the sensitive strain ATCC25922， in the drug-resistant strain QL15， genes related to efflux pump and outer membrane pore protein， namely emrB， acrB， tolC and ompC showed down-regulated expression， and ompF gene showed up-regulated expression under different environmental stress conditions. 【Conclusion】The acquisition of drug resistance of multi-drug-resistant E. coli makes it more adaptive， while its acquisition of directly available nutrients is weaker than that of sensitive strains， that is， E. coli is at a competitive disadvantage. The multi-drug resistance of drug-resistant E. coli is mainly mediated by a variety of efflux pumps and outer membrane pore proteins. Among them， the ompF gene shows up-regulated expression under pH stress， allotrophic stress， high and low temperature stress， so it is presumed that the high expression of ompF gene is beneficial to the growth of E. coli under the above stress conditions.

Key words：multi-drug-resistant Escherichia coli; pig-origin; environmental stress factors; relative adaptability;drug resistance

Foundation items： National Natural Science Foundation of China （31760749）;Guizhou Science and Technology Project （QKHPTRC〔2017〕5788，QKHJC-ZK〔2022〕yiban129）;Guizhou University Natural Science Special Items （Special Post） Scientific Research Fund Project （GDTGHZ〔2020〕25）

0 引言

【研究意义】细菌性疾病严重威胁着畜牧养殖业的健康发展（刘菊枚等，2020;付霞丽等，2021），虽然抗菌药物在动物疾病防治、促进动物生长、保障动物福利及提高养殖经济效益等方面发挥着重要作用（Bassetti et al.，2017;李玮玮等，2021），但因动物养殖过程中不合理使用及滥用抗菌药物造成的细菌耐药性问题日益严重，不仅直接影响动物性食品安全，还可通过食物链对人类健康构成威胁，解决细菌耐药问题已迫在眉睫（周瑶琴等，2018;刘昌孝，2019;刘跃华等，2019）。因此，在动物养殖“减抗、禁抗”背景下（Ghosh et al.，2019;顾晓晓等，2020），开展不同环境条件下耐药菌的生长适应性及相关耐药基因表达调控研究，对寻找无抗菌药物压力下加速细菌敏感性恢复具有重要意义。【前人研究进展】减少抗菌药物使用（减抗）是目前遏制细菌耐药性发展的重要手段之一（袁万哲等，2019），其主要理论依据是耐药细菌在无药环境中其适应性代价高于敏感菌（Andersson and Levin，1999）。Gagneux等（2006）的研究结果显示，耐利福平结核分枝杆菌产生了高额的适应性代价;Vogwill等（2015）经Meta分析发现，经药物压力细菌耐药性的产生付出了较大代价，其中染色体突变付出的适应代价通常高于质粒的获得，同时表现出耐药菌株生长趋势弱于敏感菌株;de Sousa等（2017）对克隆出的耐利福平和链霉素大肠杆菌与敏感菌进行競争试验，发现在无药物作用条件下克隆耐药菌株竞争处于弱势，但该现象可通过补偿性进化得以改变。因此，细菌在抗菌药物的选择压力下产生耐药性的相关变化，会改变细菌体内生理生化关键酶等结构，而对细菌的生长造成额外负担，进而影响细菌的部分功能，增加其适应性代价（杨焰等，2019）。耐药菌在停药后的无药环境中会因其适应性代价高于敏感菌而处于竞争劣势，逐渐被敏感菌群取代，从而降低种群的耐药水平。此外，耐药菌的适应性代价受环境差异影响，各基因间存在复杂的协同与拮抗机制，同一细菌在不同环境中的适应性代价也不同（方结红，2018）。Petersen等（2009）研究表明，在环境胁迫下链霉素耐药大肠杆菌适应性代价显著增加;商可心（2015）研究发现，鼠伤寒沙门氏菌rpsL突变介导的链霉素耐药菌在营养丰富时的生长弱于敏感菌，但在碳源缺乏时耐药菌因RpoS蛋白表达水平低，其生长优于敏感菌;Maharjan和Ferenci（2017）研究表明，rpoB突变的利福平耐药大肠杆菌在营养丰富时适应性代价较高，而在营养缺乏时其适应性更强;孙海峰等（2021）研究发现，在盐胁迫下多重耐药大肠杆菌的生长优于敏感菌，其机制可能与外膜孔道蛋白基因表达上调有关。【本研究切入点】研究耐药菌的适应性代价有助于认识干预耐药轨迹、新药研发及联合用药，提高抗生素敏感性和抑制耐药性进化，延长抗生素使用年限。适应性代价是细菌耐药性进化的重要环节，而在无抗菌药物压力下环境胁迫是细菌在自然环境中常遇的生存条件，但至今有关适应性代价在不同环境中对耐药菌的影响及其作用机制鲜见研究报道。【拟解决的关键问题】以分离自贵州省规模化猪场的多重耐药大肠杆菌QL15为研究对象，以大肠杆菌质控（敏感）菌株ATCC25922为对照，经体外竞争试验测定不同环境胁迫下耐药菌株QL15相对于敏感菌株ATCC25922的适应性，并检测其携带的耐药基因，分析耐药基因表型及外排泵和外膜孔道蛋白基因表达与细菌适应性代价的关系，旨在探究环境胁迫因子对多重耐药菌株生存适应性的影响，为创造多重耐药菌株带来高适应代价的环境及加速降低种群耐药水平提供理论依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

大肠杆菌耐药菌株QL15由贵州大学动物科学学院兽医药理实验室保存提供，敏感菌株ATCC25922购自中国兽医药品监察所。LB肉汤培养基、MH培养基及平板计数琼脂培养基购自贵州为莱科技有限责任公司;琼脂糖购自美国Sigma公司;细菌DNA提取试剂盒、RNA提取试剂盒、PCR相关试剂及RT-PCR相关试剂购自北京索莱宝科技有限公司。

1. 2 培养基制备

碳源和氮源胁迫培养基制备：参照M9基础培养基配方（王希越等，2017）进行制备，其中，碳源胁迫培养基为0.1%和0.5%葡萄糖，氮源胁迫培养基为0.01%和0.05%氯化铵，其他组份含量不变，高压灭菌后使用。酸碱胁迫培养基制备：常规LB培养基pH为7.0，分别以1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH调节LB培养基pH至5.0、6.0、8.0和9.0，高压灭菌后使用。全营养胁迫培养基：LB培养基与0.9%生理盐水比例为1∶3、1∶7和1∶15，对应的Luria-Bertani（LB）浓度分别为1/4、1/8和1/16，高压灭菌后使用。温度胁迫培养基：高温和低温胁迫条件选用LB培养基。

1. 3 不同环境胁迫下大肠杆菌生长曲线测定

采用比浊法测定敏感和耐药大肠杆菌在不同环境因子胁迫下的生长曲线（姜兴粲等，2020）。设活化敏感与耐药大肠杆菌的OD600 nm=0.5，吸取50 µL菌液置于50 mL培养基中进行恒温振荡培养。碳源胁迫、氮源胁迫、酸碱胁迫和全营养胁迫的培养温度均为37 ℃，转速为150 r/min，温度胁迫条件为42和20 ℃，每隔1 h测定其吸光值。

1. 4 不同环境胁迫下耐药大肠杆菌相对适应性测定

相对适应性表现为不同环境胁迫下耐药菌株和敏感菌株生存竞争能力的差异，主要通过体外混合培养竞争试验测定。参考本课题组前期改良的方法（孙海峰等，2021）：分别取10 μL的敏感菌株ATCC25922和耐药菌株QL15（活化后调节麦氏比浊度至0.5），置于5 mL不同胁迫条件的培养基中，在37 ℃、150 r/min的条件下进行培养（高温胁迫培养温度42 ℃，低温胁迫培养温度20 ℃）。取培养0和24 h的菌液，适当稀释后涂布在无药培养基和有药（含5 μg/mL恩诺沙星）培养基上。无药培养基的菌落数为敏感菌落和耐药菌落总数，有药培养基则为耐药菌落数，二者的差值即为敏感菌落数。混合培养0 h的敏感菌株和耐药菌株数量记录为S0和R0，培养24 h的分别记录为R24和S24，根据以下公式计算相对适应度（Relative fitness，F）：

F=ln（R24/R0）/ln（S24/S0）

1. 5 菌株外排泵与外膜孔道蛋白基因表达量测定

采用本课题组设计的引物（孙海峰等，2021），委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。敏感菌株和耐药菌株总RNA按照试剂盒操作说明进行提取。菌株外排泵与外膜蛋白基因表达量测定：将耐药菌株QL15和敏感菌株ATCC25922在37 ℃、150 r/min的条件下活化培养12 h，取50 μL菌液加入到50 mL不同环境胁迫培养基中，待细菌生长至对数生长期时，提取细菌总RNA并反转录合成cDNA，采用实时荧光定量PCR测定耐药菌株和敏感菌株外排泵与外膜孔道蛋白基因在不同环境胁迫下的相对表达量。实时荧光定量PCR反应体系及扩增程序参照孙海峰等（2021）的方法。

2 结果与分析

2. 1 不同环境胁迫下大肠杆菌的生长曲线

2. 1. 1 碳源和氮源胁迫下大肠杆菌的生长曲线

如图1所示，在不同浓度的碳源和氮源胁迫下，耐药菌株QL15与敏感菌株ATCC25922相比其生长速率更快，能更快地进入对数生长期且峰浓度均高于敏感菌株ATCC25922，表明碳源和氮源的濃度变化对耐药菌株QL15生长速率影响较小，其独立生长适应性更强。随着碳源浓度的升高，耐药菌株QL15和敏感菌株ATCC25922的生长速率均降低，而氮源浓度的升高能促进二者快速生长（图2）。此外，由图3可看出，培养10 h后不同碳源和氮源对敏感菌株ATCC25922的影响均达极显著水平（P<0.01，下同），当碳源为0.1%和氮源为0.01%时对耐药菌株QL15的影响极显著，当氮源为0.05%时对耐药菌株QL15的影响显著（P<0.05，下同），但在碳源为0.5%时对耐药菌株QL15生长无显著影响（P>0.05，下同）。同时，碳源浓度为0.5%时耐药菌株QL15的峰浓度是0.1%碳源浓度的2倍，继续增加浓度至1.0%则对峰值影响不明显，表明在一定范围内碳源对耐药大肠杆菌种群的承载度影响明显。

2. 1. 2 pH胁迫下大肠杆菌的生长曲线 不同pH对敏感菌株ATCC25922和耐药菌株QL15生长的影响如图4和图5所示。与敏感菌株ATCC25922相比，耐药菌株QL15在pH=5.0、pH=6.0和pH=8.0胁迫下均能较快地进入对数生长期，且其峰值浓度差异不显著;在pH=9.0时，耐药菌株QL15进入对数生长期的时间更快，但在对数生长期的生长速率慢于敏感菌株ATCC25922。pH=7.0是细菌生长的最适pH，pH的升高和降低均会抑制敏感菌株ATCC25922和耐药菌株QL15的生长，尤其在pH=9.0胁迫下耐药菌株QL15的生长受到明显抑制。

2. 1. 3 全营养胁迫下大肠杆菌的生长曲线 不同LB浓度对敏感菌株ATCC25922和耐药菌株QL15生长的影响如图6和图7所示。不同LB浓度胁迫下，敏感菌株ATCC25922和耐药菌株QL15进入对数生长期的时间及对数生长期的生长速率差异均不显著，但敏感菌株ATCC25922在稳定期的峰值浓度均显著高于耐药菌株QL15，表明敏感菌株在不同营养物质浓度下处于优势生长。此外，随着LB培养基稀释倍数的增加，敏感菌株ATCC25922和耐药菌株QL15对数生长期的生长速率和稳定期的峰值浓度均明显降低，表明LB浓度胁迫对细菌的生长具有明显影响。

2. 1. 4 不同温度胁迫下大肠杆菌的生长曲线 不同温度胁迫对敏感菌株ATCC25922和耐药菌株QL15生长的影响如图8所示。当温度为20 ℃时，敏感菌株ATCC25922和耐药菌株QL15的适应期时间相近且二者在培养10 h内均未到达稳定期，但耐药菌株QL15在对数生长期的生长速率更快，为优势菌株;当培养温度为42 ℃时，敏感菌株ATCC25922和耐药菌株QL15的生长曲线差异不明显，且到达稳定期的峰值浓度相近，但耐药菌株QL15在对数生长期的生长速率仍高于敏感菌株ATCC25922。比较敏感菌株ATCC25922和耐药菌株QL15在不同温度胁迫下的生长曲线，结果（图9）发现37 ℃下大肠杆菌的生长速率最高，42和20 ℃对细菌生长均有一定的抑制作用，且以20 ℃的抑制作用最大。

2. 2 耐药大肠杆菌在不同环境胁迫下的相对适应性

耐药菌株QL15的相对适应性如表1所示。在LB、碳源、氮源、pH=6.0～8.0、20 ℃和42 ℃胁迫下，耐药菌株QL15的相对适应度均大于1.00，表明其与敏感菌株ATCC25922在上述环境胁迫下竞争优势明显;耐药菌株QL15在pH=9.0及所有LB培养基稀释条件下则表现出竞争劣势（相对适应度<1.00），其中1/4 LB浓度胁迫下的相对适应度最低，仅为0.95。

2. 3 耐药大肠杆菌基因突变位点检测结果

将耐药菌株QL15和敏感菌株ATCC25922的基因组序列进行比对，共检测到509个InDel突变位点，其中Delete突变位点233个、Insert突变位点276个;共注释到71个功能基因，以细胞壁与细胞膜相关基因突变最多（10个），占14.1%，其次为氨基酸的转运与代谢（9个）占12.7%。突变涉及多种蛋白，包括磷酸转移酶、羧肽酶、细胞分裂蛋白、青霉素结合蛋白、ABC型外排系统、细胞壁水解酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶及外膜蛋白TolC等均检测到InDel位点。

2. 4 不同环境胁迫因子对大肠杆菌外排泵与外膜孔道蛋白基因表达量的影响

2. 4. 1 碳源和氮源胁迫下大肠杆菌外排泵与外膜孔道蛋白基因的相对表达量 在碳源和氮源胁迫下，大肠杆菌外排泵与外膜孔道蛋白基因的相对表达情况如图10所示。与常规的LB培养条件相比，敏感菌株ATCC25922和耐药菌株QL15中的外排泵与外膜孔道蛋白基因（acrB、ompF、emrB、tolC和ompC）相对表达量均呈下调趋势，且耐药菌株QL15的5种基因在0.5% C、0.05% N、0.01% N和1.0% C+0.1% N条件下的相对表达量较0.1% C胁迫的下调程度更大，敏感菌株ATCC25922则表现为除0.1% C和1.0% C+0.10% N条件外，其他条件下均呈显著下调。

2. 4. 2 pH胁迫下大肠杆菌外排泵与外膜孔道蛋白基因的相对表达量 敏感菌株ATCC25922和耐药菌株QL15在pH=5.0～9.0的条件下其外排泵与外膜孔道蛋白基因的相对表达量如图11所示。与pH=7.0相比，敏感菌株ATCC25922和耐药菌株QL15的emrB、acrB、tolC和ompC基因相对表达呈下调趋势，而ompF基因表达呈上调趋势。其中，ompC基因随环境pH的变化未表现出明显的变化趋势（除耐药菌株QL15在pH=9.0条件下的相对表达量外）。

2. 4. 3 全营养胁迫下大肠杆菌外排泵与外膜孔道蛋白基因的相对表达量 敏感菌株ATCC25922和耐药菌株QL15的外排泵与外膜孔道蛋白基因表达在不同LB浓度胁迫下表现出不同变化规律。随着LB稀释倍数的增加，敏感菌株ATCC25922的emrB基因表达呈上调趋势，而耐药菌株QL15的emrB基因表达呈下调趋势。2种大肠杆菌ompF基因在不同LB稀释倍数下均呈上调表达，且耐药菌株QL15的ompF基因随稀释倍数的增加其相对表达量呈递增趋势。此外，敏感菌株ATCC25922和耐药菌QL15的acrB、tolC、ompC基因相对表达量在不同LB浓度胁迫下均呈下调趋势（图12）。

2. 4. 4 高温和低温胁迫下大肠杆菌外排泵与外膜孔道蛋白基因的相对表达量 敏感菌株ATCC25922和耐药菌株QL15的外排泵与外膜孔道蛋白基因在高温和低温胁迫下的相对表达量如图13所示。敏感菌株ATCC25922和耐药菌QL15的emrB、acrB、tolC和ompC基因在20 ℃下的相对表达量较37 ℃下呈下调趋势，在42 ℃下这4种基因的相对表达量则是上调和下调趋势并存。2种大肠杆菌的ompF基因在20和42 ℃下均呈上调表达，且在42 ℃下的相对表达量高于20 ℃。

3 讨论

据统计，我国每年约有9.7万t抗菌药物用于畜牧业，接近抗菌药物年产总量的50%。由于抗菌药物的大量使用及滥用，细菌耐药性已成为全球广泛关注的公共卫生问题，意味着人类可能进入后抗生素时代（李瑞珍等，2011;Houston，2011）。目前，全球都在为降低细菌耐药性而努力，主要措施包括从源头控制抗菌药物使用、阻断耐药病原传播及开发新型药物或疫苗等。通过阻断耐药性传播和开发新型药物等方法以降低细菌的耐药性，其技术要求较高、研发较难、周期较长，且细菌耐药速度远大于新药的产出速度，因此“减抗”被世界卫生组织（WHO）列为主要措施。适应性代价是降低细菌耐药性的重要隐含机制，耐药菌株在无药物作用条件下较敏感菌株竞争劣势，二者相互竞争生长后敏感菌株会成为优势菌群，其群体敏感性得以恢复。但在无药物作用的环境中，耐药基因的敏感性恢复速度极慢，因此，寻找无药条件下加速耐药菌株敏感性恢复的方法对降低或减缓细菌耐药性具有重要意义。

本课题组前期对耐药菌株QL15的耐药基因进行检测，结果发现存在15种耐药基因（孙海峰等，2021），分别是aac（3）-IV、cmlA、ompC、ompF、acrA、tolC、emrB、emrD、tetA、blaTEM、acrB、sugE、mdtL、sul2和sul3。其中，与外排泵相关的基因有8种，外膜孔道蛋白基因有3种。AcrAB-TolC为RND外排家族，包括由融合蛋白（AcrA）、细胞质膜转运蛋白（AcrB）及外膜通道（TolC），是目前发现与大肠杆菌联系最紧密的外排泵（Yasufuku et al.，2010），能外排氨基糖苷类、β-内酰胺类、氯霉素类和大环内酯类等多种抗菌药物（黄娇和穆青，2019）。在自然环境中，AcrAB-TolC的正常表达有助于大肠杆菌抵抗肠道胆盐和脂肪酸等物质的侵入，但在某些条件下AcrAB-TolC过量表达可使大肠杆菌表现出对多种化合药物的耐受，甚至呈高水平耐受（甘露等，2020）。可见，外排泵和外膜孔道蛋白对大肠杆菌耐药性具有积极作用。

生长曲线（独立生长）和相对适应性（竞争生长）是测定细菌适应性的主要方法（杨焰等，2019）。本研究中，耐药菌株QL15在不同环境胁迫下独立生长时，表现为在0.1% C、0.5% C、1.0% C+0.10% N、0.05% N、0.01% N、pH=5.0、pH=6.0、pH=8.0、20 ℃和42 ℃中的生長状况均优于敏感菌株ATCC25922，而在pH=9.0、1/4 LB、1/8 LB和1/16 LB中的生长状况弱于敏感菌株ATCC25922。将2种大肠杆菌混合培养测定出的相对适应性，表现为耐药菌株QL15在0.1% C、0.5% C、1.0% C+0.10% N、0.05% N、0.01% N、pH=5.0、pH=6.0、pH=8.0、20 ℃和42 ℃中均处于竞争优势，而在pH=9.0、1/4 LB、1/8 LB和1/16 LB中处于劣势生长。此外，本研究发现稀释LB培养基不利耐药菌株QL15生长，但随着LB稀释倍数的增加，其相对适应性又逐渐增强，与林文芳等（2016）的研究结果相近，即贫营养和痕量抗生素对质粒抗生素抗性适应度代价有重要影响，较低的营养浓度和痕量抗生素均能增加耐药菌株的适应性代价。但某些耐药菌株的基因突变在不同营养中对其生长影响可能不同，如耐利福平大肠杆菌的rpoB基因突变在营养丰富时能抑制其生长，而在营养丰富时（铁元素、碳源和磷酸盐）具有积极作用（Maharjan and Ferenci，2017）。本研究通过比对分析耐药菌株QL15和敏感菌株ATCC25922的基因组序列，结果共检测到509个InDel突变位点，且以细胞壁和细胞膜相关功能基因居多，占注释到71个功能基因的14.1%。由此推测，耐药菌株QL15在物质转运与代谢方面得到突变增强的同时，膜相关功能基因的突变可能促使其拥有更强的膜功能，包括通透性和物质运输能力等方面，致使耐药菌株QL15在多数环境胁迫下较敏感菌株ATCC25922具有更强的适应性。

肠道细菌的存活和生长取决于pH耐受性，pH可影响RND泵底物的积累和流出，细菌在酸性条件下的培养初期，acrA和acrB基因表达下调，培养18 h后检测到基因表达显著上调（Nové et al.，2020）。耐药菌株QL15和敏感菌株ATCC25922在pH=5.0和pH=6.0胁迫下进入对数生长期的培养时间远低于18 h，且二者的acrB基因相对表达量均呈下调趋势，与Nové等（2020）的研究结果一致。此外，tolC和emrB基因的上调表达能促进大肠杆菌在极端酸性条件下存活（Deininger et al.，2011），但本研究中tolC和emrB基因的相对表达量并未上调，可能是由于pH=5.0尚未达到极端酸性条件，大肠杆菌或通过其他机制应对酸胁迫。温度是病原体在感染初期经历的关键环境信号。有研究表明，升高培养温度能增加RND泵的表达量，如荧光假单胞菌RND泵（Adebusuyi and Foght，2011）和鼠伤寒沙门氏菌AcrAB泵（Hartog et al.，2008）在35和37 ℃下的表达量均高于25和28 ℃。本研究中，acrB和tolC基因在20 ℃胁迫下呈下调表达趋势也进一步验证了该结论。

细菌能通过抗菌药物的非特异性通道蛋白OmpC和OmpF进行物质交换，既能阻碍抗菌药物进入细胞，又能促进营养吸收和有毒物质的扩散（Knopp and Andersson，2015）。如大肠杆菌在葡萄糖中的生长速度取决于其通过中央碳代谢途径的有效运输及分解代谢，凭借外膜孔蛋白（OmpC、OmpF和LamB）将葡萄糖从细胞外环境运输至周质空间（Ferenci，2001;Masi et al.，2019）。根据细胞生长的环境条件差异，糖转运系统的典型作用明显不同。特定膜外蛋白（OMPs）在葡萄糖转运中的作用因培养液中可用葡萄糖含量（痕量或过量）而异（Alva et al.，2020）。本研究中，耐药菌株QL15和敏感菌株ATCC25922的ompC基因在不同LB浓度（1/4 LB、1/8 LB和1/16 LB）胁迫下均呈下调表达，ompF基因则呈上调表达，说明在此条件下糖类营养物质可能主要通过OmpF蛋白进人细胞。但在不同碳源（0.1% C、0.5% C和1.0% C）胁迫下，2种大肠杆菌的ompC和ompF基因表达量均下调，可能是在此浓度胁迫下葡萄糖通过其他转运体系进入细胞。可见，ompF基因对细菌抗逆生长具有一定的积极作用。本研究中，ompF基因在pH胁迫、全营养胁迫和高、低温胁迫下均呈上调表达，故推测ompF基因的高表达有利于大肠杆菌在上述胁迫条件下生长。

4 结论

多重耐药大肠杆菌耐药性的获得促使其具有更强的适应性，但对可直接利用营养物质的获取弱于敏感菌株，即处于竞争劣势。耐药大肠杆菌的多重耐药性主要是由多种外排泵和外膜孔道蛋白介导完成，其中，ompF基因在pH胁迫、全营养胁迫和高、低温胁迫下均处于上调表达状态，故推测ompF基因的高表达有利于大肠杆菌在上述胁迫条件下生长。

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收稿日期：2021-12-28

基金項目：国家自然科学基金项目（31760749）;贵州省科技计划项目（黔科合平台人才〔2017〕5788号，黔科合基础-ZK〔2022〕一般129号）;贵州大学自然科学专项（特岗）科研基金项目（贵大特岗合字〔2020〕25号）

通信作者：宋旭琴（1991-），https：//orcid.org/0000-0002-8671-3161，博士，主要从事兽医药理学与毒理学研究工作，E-mail：xqsong@gzu.edu.cn;吕世明（1963-），https：//orcid.org/0000-0001-5939-0574，博士，教授，主要从事兽医药理学与毒理学研究工作，E-mail：lvlvsm@163.com

第一作者：廖书丹（1994-），https：//orcid.org/0000-0001-8419-1702，研究方向为兽医药理毒理学，E-mail：871823310@qq.com