高效液相色谱法测定黔产五倍子中没食子酸的含量Δ

2018-03-01吴亚丽王世清黄芯琦

中国医院用药评价与分析 2018年1期

钟可，吴亚丽，王世清,2#，黄芯琦，刘珂

(1.贵阳中医学院药学院，贵州贵阳 550025； 2.国家苗药工程技术研究中心，贵州贵阳 550025)

五倍子为常用中药，始载于《本草拾遗》[1]，来源于漆树科植物盐肤木、青麸杨和红麸杨叶上的虫瘿，主要由五倍子蚜寄生而形成，具有敛肺降火、涩肠止泻、敛汗、止血和收湿敛疮的功效[2]。现代药理研究结果表明，五倍子具有抗菌、抗氧化和收敛作用[3-5]，临床上用于防治龋病，治疗口疮、上消化道出血、遗精[6-7]及肛瘘、痔疮等肛肠疾病[8-9]，其复方制剂可用于急性湿疹的治疗[10]。根据五倍子的性状特征，将其分为角倍类、肚倍类和倍花类[11]。我国五倍子产量占世界总产量的95%以上，以产量高、质量好著称，国内产区主要集中在贵州省、四川省、湖北省、湖南省、陕西省和云南省[12-13]。五倍子是贵州省著名的道地药材之一，主要分布于遵义地区、黔东南、黔南和铜仁等地区，中部、南部和西部地区分布较少[14]。五倍子的主要化学成分为鞣质[15]，鞣质是葡萄糖上的羟基与没食子酸所形成的酯类化合物的混合物，在酸性条件下，可水解为没食子酸，故没食子酸的含量可反应出鞣质的含量。本研究采用高效液相色谱法测定了不同产地、不同性状特征和不同采收时间的黔产五倍子药材中没食子酸的含量，为五倍子的质量研究提供依据。

1 材料

1.1 仪器

LC-20AT型高效液相色谱仪(日本岛津公司)；Thermo BDS HYPERSIL C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；AL204-lc型万分之一天平[梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司]。

1.2 药品与试剂

五倍子样品均野外采集，经贵阳中医学院王世清教授鉴定，来源见表1。没食子酸对照品(中国食品药品鉴定研究所，纯度：89.9%，批号：110831—201204)；甲醇(色谱纯，TEDIA天地试剂公司)；甲醇(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；烟酸(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；水为娃哈哈纯净水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为Thermo BDS HYPERSIL C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为甲醇-0.5%磷酸溶液(V∶V=15∶85)；检测波长为273 nm；柱温为30 ℃。

2.2 对照品溶液的制备

取没食子酸对照品适量，精密称定，加50%甲醇溶解，制成质量浓度为39.92 μg/ml的对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

精密称定过四号筛(65目)并已烘至恒质量的五倍子药材粉末约0.5 g，精密加入4 mol/L的盐酸溶液50 ml，水浴加热水解3.5 h，放冷滤过；精密量取续滤液1 ml，置于100 ml容量瓶中，加50%甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，过0.45 μm微孔滤膜，即得。

2.4 系统适应性试验

精密量取“2.2”“2.3”项下对照品溶液、供试品溶液各10 μl，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图，见图1。理论板数按没食子酸峰计算应≥3 000。

2.5 方法学考察

2.5.1 精密度试验：取对照品溶液10 μl，按“2.1”项下方法连续进样测定6次，记录峰面积。结果表明，没食子酸峰面积的RSD为1.39%，仪器精密度良好。

2.5.2 重复性试验：精密称定样品(编号：16)粉末6份，每份约0.5 g，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下方法进样测定，记录峰面积，计算没食子酸含量。结果表明，没食子酸含量分别为65.862 2、66.520 5、64.828 1、67.905 7、64.641 8和65.375 2 mg/g，RSD为1.85%，本方法重复性良好。

2.5.3 稳定性试验：取供试品溶液(编号：16)适量，于室温(25 ℃)下放置0、2、4、8、12和24 h时按“2.1”项下方法进样测定，记录峰面积。结果表明，没食子酸峰面积的RSD为1.51%，供试品溶液在24 h内稳定性良好。

表1 五倍子的来源及类别 Tab 1 The originsand categories of Guizhou galla chinensis

2.5.4 线性关系考察：取没食子酸对照品，按“2.2”项下方法分别制得质量浓度为10.365、31.096、51.827、62.193、75.558和93.289 μg/ml的对照品溶液，再按“2.1”项下方法进样10 μl，记录峰面积。以峰面积为纵坐标(Y)，没食子酸质量浓度为横坐标(X)，得到线性回归方程为Y=33 048X+38 444(R2=0.999 9)，表明没食子酸在10.365～93.289 μg/ml范围内线性关系良好。标准曲线见图2。

2.5.5 加样回收率试验：精密称取已知含量的样品(编号：16)粉末6份，每份约0.25 g，置于锥形瓶中，加入没食子酸对照品0.164 7 g，按“2.3”项下方法制得供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件下进样测定，记录峰面积，计算没食子酸含量。结果表明，没食子酸的平均加样回收率为97.88%，RSD为0.85%，见表2。

A.对照品； B.供试品 A.reference substance；B.test sample图1 高效液相色谱图 Fig 1 HPLC chromatogram

图2 线性关系的标准曲线 Fig 2 Standard curve of linear test

样品量/g样品含量/g加入量/g测得量/g加样回收率/%平均加样回收率/%RSD/%0.25010.16470.16410.324898.780.25000.16470.16410.318896.960.25020.16470.16410.320897.570.25000.16470.16410.319497.140.24990.16470.16410.325498.970.25020.16470.16410.321797.8497.880.85

2.6 含量测定

分别精密称取烘至恒质量的各批样品粉末(过四号筛，65目)0.5 g，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，平行制备3份，再按“2.1”项下色谱条件下进样测定，记录色谱图，计算五倍子药材中没食子酸的含量。结果表明，肚倍(8批)的没食子酸含量为62.81%～74.79%，平均68.26%；角倍(13批)的没食子酸含量为52.68%～76.05%，平均69.55%；倍花(23批)的没食子酸含量为25.71%～53.31%，平均35.07%，见表3。

表3 没食子酸的含量测定结果(n=3) Tab 3 The content determination results of gallic acid in Guizhou galla chinensis(n=3)

3 讨论

《中华人民共和国药典：一部》(2015年版)规定，五倍子按干燥品计算，含鞣质以没食子酸(C7H5O6)计，不得少于50.00%。本研究结果表明，黔产肚倍与角倍的没食子酸含量均达到标准，而倍花中没食子酸的含量远远低于角倍和肚倍，在23个样品中仅有5号样品没食子酸的含量为53.31%，其他均<50%。从没食子酸含量的角度考虑，倍花不能入药使用，《中华人民共和国药典：一部》(2015年版)五倍子药材中未收载倍花是有依据的。但野外采样过程中发现大量倍花的存在，市场调查中也发现肚倍和角倍中混有倍花的情况。采收时间不同的同一产地和性状的五倍子，其没食子酸的含量有所不同。如本研究中，贵阳市黔灵公园所采集的的肚倍(编号：1—4)中没食子酸含量有明显的区别。不同地区不同采集时间的五倍子中没食子酸的含量不同，表明五倍子中没食子酸含量与其采收时间有关。过早采收，则虫瘿尚未长大，没食子酸含量偏低，经济价值及药用价值都无法最大化；过晚采收，五倍子蚜虫会破壁而出，影响药材的性状，且没食子酸含量降低。因此，合理的采收时间对五倍子的质量非常重要。

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