岩黄连水提物对肝癌HepG2细胞增殖和迁移能力的影响及其可能机制

鞠佳霓 明志勇 代全楷 李科志 黄山 何剑波 邬国斌 陈闯

原发性肝癌是最常见的恶性肿瘤之一，发病率和死亡率均较高，严重威胁人类健康［1］。肝癌治疗强调多学科协作［2］，其中中医药可以缓解肝癌患者症状，稳定瘤体，提高生存质量［3］。岩黄连是一种“壮药”，为罂粟科多年生草本植物，主要分布于广西和贵州等石山地区，性凉，味苦，归肝经，具有清热解毒、利湿、止痛止血、抗菌、消炎及抗肿瘤作用［4］，但岩黄连抗肝癌的作用机制尚未十分明确。本研究将岩黄连水提物与肝癌HepG2细胞共同培养，观察其对肝癌HepG2细胞增殖和迁移的影响，并探讨可能的作用机制，为肝癌治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

人肝癌细胞株HepG2由广西医科大学附属肿瘤医院中心实验室提供。胎牛血清和DMEM培养基均购自Gibco公司，活细胞计数试剂盒（cell counting kit-8，CCK8）购自同仁化学研究所，Transwell小室购自Corning公司，TRIzol购自Ambion公司，反转录试剂盒及荧光定量PCR试剂盒购自日本TaKaRa公司，免疫印迹试验设备购自美国Bio-Rad公司，NF-κBp65抗体购自北京博奥森生物技术有限公司，岩黄连购自南宁市景昌中药饮片有限公司。取200 g岩黄连，加入500 mL超净水，浸泡30 min后煎煮，煮沸后文火煎60 min，滤布滤过，药渣以300 mL水煎30 min，合并2次药液，离心后过滤，经旋转蒸发仪蒸发浓缩至350 mL，最后用冻干机制成冻干粉剂23.4 g（8.54 g生药量/1 g冻干粉），取一定量制备好的冻干粉，用DMEM培养基配置成浓度为0.4 mg/mL、0.8 mg/mL、1.6 mg/mL的含药培养基各100 mL，37℃水浴锅溶解离心后用0.22 μm过滤器过滤除菌，分装，-20℃保存备用。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及分组 将肝癌HepG2细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，在37℃、5%CO2饱和湿度条件下培养、传代。以含不同浓度岩黄连水提物（0.4 mg/mL、0.8 mg/mL、1.6 mg/mL）培养基100 mL分别作用于肝癌HepG2细胞，以等量未处理培养基培养的肝癌HepG2细胞为对照组。

1.2.2 CCK-8法检测肝癌HepG2细胞的增殖能力 取对数生长期肝癌HepG2细胞，0.05%胰蛋白酶消化，1 000 r/min离心5 min，PBS洗涤3次，加入含10%胎牛血清DMEM培养液中制成单细胞悬液，接种于96孔板，每孔约3 000个细胞，培养24 h。培养24 h、48 h、72 h时分别加入 CCK-8 溶液 10 μL/孔，置于 5%CO2、37℃培养箱孵育1 h，用酶联仪在450 nm波长下检测每孔吸光值。实验设置5个复孔，重复3次。计算细胞增殖抑制率，计算公式为细胞增殖抑制率=［1-（岩黄连水提物组吸光值/对照组吸光值）］×100%。

1.2.3 Transwell法检测肝癌HepG2细胞的迁移能力

在下室加入600 μL含10%胎牛血清培养基，上室加入100 μL经上述处理48 h的肝癌HepG2细胞悬液，约5×104个细胞，培养24 h。用镊子取出小室，吸出上室液体，用湿棉签拭去微孔膜上层细胞，甲醇固定30 min，吉姆萨染色50 min，清洗2次后于显微镜下观察，每个小室至少计数5个视野，每组2个平行孔，计算各组小室透过基底细胞膜的平均细胞数。

1.2.4 RT-qPCR检测NF-κBp65 mRNA的表达水平

收集经上述处理48 h的肝癌HepG2细胞悬液，加入1 mL TRIzol，按照说明书提取总RNA。按照反转录试剂盒操作方法将总RNA反转录为cDNA。RT-qPCR以SYBR Green染料为荧光检测信号，按照SYBR Premix Ex Taq试剂盒说明，每组的Real-time PCR体系为20 μL。各组每个基因均设3个复孔。GAPDH作为内参，RT-qPCR引物见表1。反应条件：95℃预变性2 min，95℃变性15 s，60℃退火并延伸30 s，共42个循环。采用2-△△Ct计算目的基因相对表达量。△△Ct值=［岩黄连水提物组靶基因Ct值-岩黄连水提物组GAPDH Ct值］-［对照组靶基因Ct值-对照组GAPDH Ct值］，实验重复3次。

表1RT-qPCR引物序列

1.2.5 Western blot检测NF-κBp65蛋白表达水平 收集经上述处理48 h的肝癌HepG2细胞悬液，提取细胞总蛋白，二喹啉甲酸蛋白分析法测定蛋白浓度。各孔加入30 μg蛋白样品，10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，然后转移到PVDF膜，50 g/L脱脂奶粉封闭2 h。4℃孵育NF-κBp65抗体过夜。次日室温孵育二抗1 h，TBST洗涤3次，用化学发光法显影曝光，图片经Image lab软件分析灰度值，蛋白相对表达量=目的蛋白条带灰度值/内参蛋白条带灰度值。实验重复3次。

1.3 统计学方法

采用SPSS 16.0软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组比较采用单因素方差分析，若整体差异有统计学意义，进一步的多重比较采用Bonferroni检验。以双侧P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 岩黄连水提物对肝癌HepG2细胞增殖能力的影响

CCK-8实验结果显示，0.4 mg/mL岩黄连水提物作用24 h、48 h和72 h，肝癌HepG2细胞增殖抑制率差异有统计学意义（F=44.925，P＜0.001），且 48 h的细胞增殖抑制率高于24 h（P＜0.01），72 h时则表现为促进肝癌HepG2细胞生长（P＜0.01）。0.8 mg/mL和1.6 mg/mL浓度分别处理24 h、48 h和72 h，肝癌HepG2细胞增殖抑制率差异均有统计学意义（P＜0.01），且48 h和72 h的细胞增殖抑制率均高于24 h（P＜0.01）。不同浓度作用24 h、48 h和72 h的细胞增殖抑制率差异均有统计学意义（P＜0.01），且0.8 mg/mL和1.6 mg/mL浓度处理的细胞增殖抑制率均高于0.4 mg/mL浓度处理的细胞增殖抑制率（P＜0.01）。见表2。

表2 不同浓度岩黄连水提物对肝癌HepG2细胞增殖的影响

2.2 岩黄连水提物抑制肝癌HepG2细胞的迁移能力

Transwell实验结果显示，对照组、0.4 mg/mL、0.8 mg/mL、1.6 mg/mL岩黄连水提物组的细胞迁移数分别为 （208.00±7.64） 个、（176.00±10.20） 个、（133.00±7.54）个和（99.70±4.50）个，差异有统计学意义（F=113.6，P＜0.001），且各浓度岩黄连水提物组的细胞迁移数均低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.001）。见图 1。

图1 Transwell实验检测不同处理组肝癌HepG2细胞的迁移能力（吉姆萨染色×100）

2.3 岩黄连水提物上调NF-κBp65 mRNA的表达

不同浓度岩黄连水提物作用肝癌HepG2细胞48 h后，RT-qPCR实验结果显示，对照组、0.4 mg/mL、0.8 mg/mL和1.6 mg/mL岩黄连水提物组NF-κBp65 mRNA 的相对表达量分别为 1.00、1.94 ±0.15、4.41±0.36、26.03±8.28，差异有统计学意义（F=27.510，P＜0.001）；0.4 mg/mL、0.8 mg/mL 和 1.6 mg/mL 组的 NF-κBp65 mRNA表达量均高于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.001）。见图 2。

图2 RT-qPCR实验检测不同处理组肝癌HepG2细胞NF-κBp65 mRNA 的表达

2.4 岩黄连水提物上调NF-κBp65蛋白的表达

不同浓度岩黄连水提物作用肝癌HepG2细胞48 h后，Western blot实验结果显示，对照组、0.4 mg/mL、0.8 mg/mL和1.6 mg/mL岩黄连水提物组NF-κBp65蛋白表达量分别为 0.50±0.04、0.77±0.08、1.05±0.15、1.44±0.04，差异有统计学意义（F=60.380，P＜0.001）；0.4 mg/mL、0.8 mg/mL 和 1.6 mg/mL 组 NF-κBp65蛋白表达量均高于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.001）。见图3。

图3 Western blot实验检测不同处理组肝癌HepG2细胞NF-κBp65蛋白的表达

3 讨论

目前原发性肝癌治疗效果尚不理想，尤其是中晚期肝癌，多学科综合治疗是有效的治疗模式。研究显示中医药治疗在肝癌防治中有一定作用［5］。岩黄连具有抗炎、抗病毒、抗癌等功效，常用于治疗肝炎、肝癌，但目前尚无国家质量标准，发挥作用的有效成分亦不明确。半体内法抗肿瘤实验［6］发现，岩黄连碱在1∶300浓度下对小白鼠肉瘤180、小白鼠腹水型肝癌、小白鼠艾氏腹水癌及大白鼠癌肉瘤256细胞均有显著的抑制作用。本研究采用不同浓度岩黄连水提物作用于肝癌HepG2细胞，结果发现岩黄连水提物浓度在 0.4 mg/mL、0.8 mg/mL、1.6 mg/mL 下作用 24 h、48 h，肝癌HepG2细胞增殖均受抑制，其中在1.6 mg/mL浓度下作用48 h表现出最强的抑制作用，因此采用Transwell法检测48 h时不同浓度岩黄连水提物对肝癌HepG2细胞迁移能力的影响，发现0.4 mg/mL、0.8 mg/mL和1.6 mg/mL岩黄连水提物组的细胞迁移数均低于对照组，说明岩黄连水提物可降低肝癌HepG2细胞迁移能力，对细胞生长有一定抑制作用。有研究表明同一味药物所含成分不同、剂量变化、采收时节、炮制方法、入药部位、配伍不同、机体状态等都可使中药显示出双向调节作用［7］。本研究在作用 72 h 时，0.8 mg/mL、1.6 mg/mL岩黄连水提物仍表现为抑制作用，但0.4 mg/mL却表现为促进作用，体现了岩黄连水提物双向调节作用，但其作用机制不明。

肝癌的发生与炎症密切相关，炎症在肝癌的发生和转移过程中具有促进作用［8］。NF-κB是一类重要的转录因子，p65和p50是其活性形式的主要部分，可参与多种基因表达与调控，在肝癌发生发展中起重要作用［9］。目前已经发现一系列受NF-κBp65调控的基因，这些靶基因产物可广泛参与炎症反应及细胞增殖、分化、衰老、凋亡等生理和病理过程［10］。Wang 等［11］研究发现miR503HG通过减少p52稳定性和p65mRNA，影响NF-κB途径和异质性核糖体蛋白A2/B1泛素化，从而抑制肝细胞癌迁移。Chen等［12］研究报道白杨素通过影响MAPK和NF-κB信号通路抑制黑色素瘤细胞A375迁移和侵袭。岩黄连具有抗炎、抗病毒、抗癌等功效，其活性成分小檗碱型生物碱类化合物小檗碱、四氢非洲防己碱等有潜在的抗HBV活性和肝保护活性［13］。Li等［14］研究证实岩黄连中有效成分小檗碱可通过NF-kBp65通路抑制肝癌HepG2细胞增殖，发挥对肝癌的抗肿瘤活性。Dai等［15］通过体内外实验研究发现小檗碱与HMQ1611联合能抑制Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白的表达，从而抑制肝癌细胞增殖和迁移。本研究分别采用Western blot和RT-qPCR检测不同浓度岩黄连水提物作用肝癌HepG2细胞48 h后NF-κBp65蛋白和mRNA的表达水平，结果不同浓度岩黄连水提物作用后NF-κBp65蛋白和mRNA表达均升高，提示岩黄连水提物可能通过上调NF-κBp65表达抑制肝癌HepG2细胞增殖、迁移。有研究报道哺乳动物细胞中NF-κBp65与p50结合形成p65/p50二聚体，在静止状态下，NF-κB 由 p50、p65 和 IκB 组成异源三聚体存在于细胞质中。本研究肝癌HePG2细胞可能在岩黄连水提物作用下，导致NF-κBp65活化，然后转位到细胞核并在相应的靶基因上与特定的DNA结合，从而发挥抑制细胞增殖与迁移作用［16］，但是否通过岩黄连的小檗碱成分调节NF-kBp65通路而发挥抑制肝癌HepG2细胞增殖、迁移的作用未知。此外中药是多靶点、多层次、多阶段综合作用的结果，本研究采用的岩黄连水提物是一种复合物，含有多种化合物，作用机制复杂，因此其对肝癌增殖、迁移作用的机制及其有效成分仍有待进行系统药理学研究证实。