白藜芦醇对非小细胞肺癌细胞自噬和凋亡的影响

张云珍 邵松军余红 袁国航方海燕

肺癌发病例数和死亡例数在我国均居首位，其中非小细胞肺癌（non-small cell carcinoma，NSCLC）占75%～85%［1-2］。自噬是细胞内蛋白降解的主要途径之一，其通过自噬-溶酶体途径将受损蛋白质及老化的细胞器等运输到溶酶体进行降解，实现细胞代谢需要和某些细胞器更新。研究发现在人胃癌、前列腺癌等肿瘤细胞中，自噬可抑制细胞增殖、加速细胞凋亡［3-5］。白藜芦醇（resveratrol，Res）是一种从花生、葡萄等植物中提取的天然多酚类化合物，具有抗纤维化、抗肿瘤和抑制细胞增殖、促进细胞凋亡等作用［6-7］。在神经胶质瘤细胞［8］和乳腺癌细胞［9］中，白藜芦醇可通过促进肿瘤细胞自噬而发挥杀伤作用。但白藜芦醇对NSCLC细胞自噬和凋亡的影响少见报道。本研究采用白藜芦醇作用NSCLC A549细胞，并观察其对自噬水平和细胞凋亡的影响，以期为NSCLC的治疗提供新的依据和靶点。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

白藜芦醇购自美国Sigma公司，DMEM培养基购自美国Hyclone公司，胎牛血清（FBS）购自美国Gibco公司，DAPI溶液、RIPA强裂解液均购自北京索莱宝生物技术有限公司，蛋白酶抑制剂混合物购自上海康成生物有限公司，双抗（青霉素、链霉素）购自武汉普诺赛生命科技有限公司，BCA蛋白含量测定试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司，自噬双标腺病毒（mRFP-GFP-LC3）购自上海汉恒生物技术有限公司，超敏ECL化学发光试剂盒购自美国Bio-Rad公司，caspase-3、LC3Ⅱ/Ⅰ、p62等抗体均购自美国 CST 公司，Bax、Bcl-2、Beclin1、GAPDH 等抗体均购自美国Proteintech公司，辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG、羊抗鼠IgG均购自武汉普瑞美斯生物有限公司，荧光二抗羊抗兔购自美国Abcam公司。

1.2 细胞培养及分组

NSCLC细胞株A549细胞购自广州吉尼欧生物科技有限公司。将A549细胞复苏后接种于10 cm2培养皿中，加入含10%FBS、1%双抗的DMEM培养基，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。待细胞生长融合至80%时，用0.25%胰蛋白酶消化液消化，每2～3 d传代，取对数生长期的A549细胞进行后续实验。

将A549细胞按5×105/孔接种于6孔板中，加入含10%FBS的培养基，置于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养过夜，第2天更换无血清DMEM培养基静止24 h，使细胞生长同步化，将细胞分为对照组和Res组，对照组用2%FBS的DMEM培养，Res组用2%FBS+50 μmol/L白藜芦醇的DMEM培养。

1.3 倒置显微镜观察A549细胞形态

将细胞接种在6孔板中，白藜芦醇处理24 h后在倒置显微镜下观察两组细胞的形态。

1.4 激光扫描共聚焦显微镜观察A549细胞自噬体的形成

细胞爬片后，待A549细胞生长融合至50%～60%，用mRFP-GFP-LC3病毒感染24 h后加雷帕霉素诱导12 h，再用白藜芦醇预处理24 h，然后用激光扫描共聚焦显微镜观察两组细胞自噬体的形成。

1.5 Westernblot检测自噬相关蛋白Beclin1、LC3Ⅱ/Ⅰ、p62和凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、活化caspase-3的表达

将10 cm2培养皿中的对照组和Res组细胞用PBS洗3遍，用RIPA强裂解液和蛋白酶抑制剂PMSF提取细胞蛋白，BCA试剂盒测定总浓度。SDS-PAGE电泳分离蛋白，转膜，封闭，抗 Bcl-2（1∶1 000）、Bax（1∶1 000）、活化 caspase-3（1∶1 000）、Beclin1（1∶1 000），LC3 Ⅱ/Ⅰ（1∶1 000）、p62（1∶1 000）、GAPDH（1∶5 000），4℃孵育过夜，室温孵育辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG（1∶6 000）、羊抗小鼠 IgG（1∶6 000），ECL 发光液曝光，用Image Lab软件分析。以目的蛋白条带的灰度值和内参GAPDH的蛋白条带灰度值的比值确定目的蛋白的相对表达水平，每组实验设置3个复孔。

1.6 统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析，计量数据以均数±标准差（±s）表示，两组数据比较采用独立样本t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 倒置显微镜下观察白藜芦醇干预A549细胞后的形态

A549细胞培养24 h后，对照组镜下可见细胞呈不规则形，细胞之间紧密连接，贴壁生长良好；Res组镜下可见部分细胞形状开始变圆，排列稀疏，细胞之间连接较松散，贴壁细胞较对照组减少，见图1。

图1 倒置显微镜下观察A549细胞的形态（×200）

2.2 激光扫描共聚焦显微镜观察A549细胞自噬体的形成

白藜芦醇干预24 h后，激光扫描共聚焦显微镜观察到Res组A549细胞胞浆内可见大量自噬体形成（点状聚集），而对照组则无明显的自噬体形成，见图2。

图2 激光扫描共聚焦显微镜观察A549细胞自噬体的形成（×400）

2.3 A549细胞中自噬和凋亡相关蛋白的表达

白藜芦醇干预24 h后提取蛋白，Western blot检测结果显示，与对照组比较，Res组A549细胞自噬相关蛋白 Beclin 1、LC3Ⅱ/Ⅰ表达升高（0.151±0.032vs0.093±0.013，P=0.011；3.644±0.122vs1.903±0.054，P＜0.001），p62 蛋白表达下降（0.032±0.002vs0.061±0.005，P=0.021），见图 3A。与对照组比较，Res组A549细胞凋亡相关蛋白Bax、活化caspase-3表达升高（0.633±0.061vs0.423±0.053，P=0.011；0.154±0.004vs0.111±0.011，P=0.002），Bcl-2 蛋白表达下降（2.437±0.055vs3.503±0.138，P＜0.001），见图 3B。

3 讨论

白藜芦醇是一种多酚类化合物，近年较多研究报道了白藜芦醇的抗肿瘤作用［10］。有研究发现，白藜芦醇能通过PI3K/Akt信号通路等途径诱导细胞凋亡，抑制软骨肉瘤细胞增殖［11］；而白藜芦醇类似物3，4，4′-THS可通过线粒体和内质网途径诱导NSCLC细胞发生凋亡［12］。Fang等［13］研究发现白藜芦醇可通过STAT-3信号通路抑制NSCLC A549细胞增殖并促进其凋亡。在胃癌细胞中，白藜芦醇能抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达并激活NF-κB，从而促进癌细胞凋亡［14］，以上研究提示白藜芦醇可能通过促进癌细胞自噬从而诱导其凋亡。本研究采用白藜芦醇干预NSCLC A549细胞24 h后，观察到细胞形状较正常变圆，细胞排列较稀疏，提示细胞可能开始发生凋亡。Western blot进一步检测凋亡相关蛋白，发现Res组中促凋亡蛋白Bax和线粒体凋亡蛋白活化caspase-3表达增加，而抑凋亡蛋白Bcl-2表达量减少，提示白藜芦醇干预A549细胞后其细胞凋亡水平上升。分析原因可能是外界应激作用于线粒体细胞通路后，细胞色素C等小分子得到释放，从而下调Bcl-2，上调Bax，继而使活化caspase家族出现级联反应，最终诱导细胞发生凋亡，与文献报道一致［12，15］。

图3 不同处理组A549细胞自噬相关蛋白和凋亡蛋白的表达

自噬是细胞受到外界刺激下的自我保护机制，研究表明在神经胶质瘤和人中性粒细胞中，自噬可加速细胞凋亡，抑制细胞增殖［16-17］，其机制可能是自噬可清除受损线粒体，使细胞色素C水平减少，从而抑制线粒体途径诱导细胞凋亡［18］。本研究发现，白藜芦醇干预可促使A549细胞凋亡，为探究这一现象是否通过促进细胞过度自噬而发挥作用，本研究采用激光扫描共聚焦显微镜观察细胞自噬小体的形成情况，Western blot检测自噬相关蛋白 Beclin1、LC3Ⅱ/Ⅰ、p62的表达，结果发现白藜芦醇干预A549细胞后，自噬相关蛋白Beclin 1、LC3Ⅱ/Ⅰ表达增加，但自噬消化底物p62的表达量有所下降，原因可能是自噬上游表达增强或者下游降解阻断，都会导致p62的聚集，最终p62纳入成熟的自噬体内，并在自噬体内降解，从而激活细胞过度自噬。绿色荧光蛋白GFP对酸性较敏感，当溶酶体与自噬小体融合形成自噬溶酶体时，GFP变弱，因此只能检测到红色荧光，而红色荧光即指示自噬溶酶体。本研究用mRFP-GFP-LC3病毒感染，在激光扫描共聚焦显微镜下可观察到Res组细胞胞浆内大量自噬小体形成，说明白藜芦醇干预后，A549细胞的“自噬流”水平有所上升，细胞自噬显著增加，再次印证Western blot检测结果，同时凋亡蛋白表达增加，提示白藜芦醇可能通过促进细胞过度自噬从而导致A549细胞凋亡，达到抗肿瘤的目的，有望为肺癌的临床防治提供新的靶点和思路。但是二者相互作用的具体机制仍未知，后续将联合应用自噬促进剂或抑制剂从细胞和动物两方面进行研究，并探讨经典PI3K/Akt信号通路和线粒体途径，进一步深入研究自噬和凋亡的机制。