过表达THBS2对宫颈鳞癌SiHa细胞生物学特性的影响

董婷婷 戴盛康 龙颖 伍光腾 冯一鸣 徐勋 卢艳 姚德生

宫颈癌是女性常见的恶性肿瘤之一，与人乳头状瘤病毒持续感染关系密切［1］。宫颈癌的治疗主要以手术、放疗和化疗为主，但晚期和复发患者疗效不理想［2］，分子靶向治疗为其提供了新的线索。血小板反应蛋白 2（thrombospondin-2，THBS2）是 THBS 蛋白家族中的一员，广泛存在于上皮来源组织的细胞外基质糖蛋白，对细胞黏附能力、增殖以及凋亡等有调节作用［3］。研究发现THBS2在胃癌、前列腺癌和宫颈癌组织中呈低表达，且可影响患者预后［4-6］。然而THBS2调节宫颈癌细胞生物学功能的相关机制尚不明确，本课题组前期研究发现宫颈鳞癌组织中mir-1246呈异常表达，且证实THBS2为mir-1246的靶基因［7］。本研究通过在宫颈鳞癌SiHa细胞中过表达THBS2，观察其对SiHa细胞增殖、凋亡、侵袭、迁移等生物学特性的影响，同时建立裸鼠模型，观察其体外成瘤能力，以探讨THBS2在宫颈鳞癌发生发展中的作用，为其治疗提供新的依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料与仪器

宫颈鳞癌SiHa细胞株购自上海吉凯基因公司，用含10%胎牛血清及10 IU/mL青霉素-链霉素的DMEM培养基，在37℃、5%CO2条件下培养，取对数生长期细胞进行实验。DMEM培养基购自美国gibco公司，THBS2过表达慢病毒转染试剂购自上海吉凯基因公司，cDNA反转录试剂盒购自日本TaKaRa公司，THBS2抗体购自美国Santa Cruz公司，内参GAPDH抗体购自美国Cell Signaling Technology公司，IX51型荧光显微镜购自日本Olympus公司。

1.2 细胞转染与分组

将宫颈鳞癌SiHa细胞接种于6孔板中，根据上海吉凯基因公司提供的慢病毒转染说明书进行，实验分为3组：THBS2-LV组（转染THBS2过表达慢病毒的宫颈鳞癌SiHa细胞）、NC组（转染空载病毒的宫颈鳞癌SiHa细胞）、空白对照组（正常培养的宫颈鳞癌SiHa细胞）。转染慢病毒72 h后，在实时荧光显微镜下初步观察转染效率，待细胞密度达80%左右转移至25 cm2培养瓶继续培养。

1.3 RT-qPCR检测宫颈鳞癌SiHa细胞THBS2 mRNA的表达

取转染后并经嘌呤霉素筛选的THBS2-LV组、NC组以及空白对照组宫颈鳞癌SiHa细胞，采用吸附柱法提取总RNA。按cDNA反转录试剂盒说明书进行操作，将RNA反转录为cDNA，以此为模板进行扩增。THBS2序列：上游引物为5'-AGCTGGTTCAGACAGCCAACTC-3'，下游引物为5'-CATAGTCGTCGTCCCGGTCA-3'；内参GAPDH序列：上游引物为5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'，下游引物为5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'。反应总体积为 20 μl，其中 cDNA 模板 2 μL、上下游引物分别为 0.8 μL、SYBR混合物10 μL、无菌蒸馏水6.4 μL。反应条件：预变性95 ℃ 30 s；PCR 反应 95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s，共 40个循环；溶解分析95℃ 15 s、60℃ 60 s、95℃ 15 s。反应结束后采用2-△△Ct法计算THBS2的相对表达量，实验重复3次。

1.4 Western blot检测宫颈鳞癌SiHa细胞THBS2的表达

取转染后并经嘌呤霉素筛选的THBS2-LV组、NC组以及空白对照组宫颈鳞癌SiHa细胞，将细胞从培养瓶转移至1.5 mL EP管中，1 000 r/min离心5 min，弃上清液，在细胞沉淀中加入RIPA蛋白裂解液和PMSF蛋白酶抑制剂混合液于冰上裂解30 min，以12 000 r/min离心10 min。在THBS2-LV组、NC组和空白对照组细胞蛋白样品中添加上样缓冲液，100℃变性5 min。每个凝胶泳道以50 μL蛋白样品上样，以湿转法将蛋白转移至PVDF膜，将膜置于5%的脱脂奶粉中封闭2 h，加入对应一抗鼠抗THBS2抗体（体积稀释比例为1∶100）和鼠抗GAPDH抗体（体积稀释比例为1∶1 000）在4℃下孵育过夜。加入二抗兔抗鼠（体积稀释比例为1∶1 000）孵育1 h，ECL化学发光显色，并用凝胶成像仪观察分析，实验重复3次。

1.5 CCK-8法检测宫颈鳞癌SiHa细胞增殖能力

取转染后并经嘌呤霉素筛选的THBS2-LV组、NC组以及空白对照组宫颈鳞癌SiHa细胞，以密度为5 000个/孔取100 μL加入96孔板中，分别培养24 h、48 h、72 h，检测前每孔加入 10 μL CCK-8 工作液，于37℃培养箱中孵育1 h，然后采用酶联免疫检测仪检测吸光度值（OD值），记录结果，绘制细胞生长曲线；实验重复3次。

1.6 流式细胞术检测宫颈鳞癌SiHa细胞凋亡能力

取转染后并经嘌呤霉素筛选的THBS2-LV组、NC组以及空白对照组宫颈鳞癌SiHa细胞，用0.25%不含EDTA的胰酶消化，1 000 r/min离心5 min，用PBS重悬离心2次，离心后用100 μL 1×Binding Buffer制成细胞悬液，先后加入5 μL APC AnnexinⅤ和5μL7-ADD染液，常温孵育15 min后置于冰上，1 h内用流式细胞仪检测细胞凋亡率，实验重复3次。

1.7 细胞划痕实验检测宫颈鳞癌SiHa细胞迁移能力

取转染后并经嘌呤霉素筛选的THBS2-LV组、NC组以及空白对照组宫颈鳞癌SiHa细胞，接种于6孔板内，待细胞长满后，用已灭菌消毒的200 μL枪头在细胞底部划痕，分别于0 h、24 h、48 h在显微镜下拍照，观察细胞迁移及愈合能力，实验重复3次。

1.8 Transwell实验检测宫颈鳞癌SiHa细胞侵袭能力

取转染后并经嘌呤霉素筛选的THBS2-LV组、NC组以及空白对照组宫颈鳞癌SiHa细胞，用无血清的DMEM培养液重悬细胞，使细胞终密度为5×105个/mL。取出于4℃溶解好的Matrigel胶，用DMEM培养基按1∶8稀释，取80 μL混合液加入Transwell小室上室底部，置于37℃培养箱待Matrigel胶凝固后取出，将100 μL细胞悬液加入Transwell小室上室，下室为含20%胎牛血清的DMEM培养基，放入恒温培养箱24 h，4%多聚甲醛固定30 min，革兰液染色10 min，晾干。光学显微镜下观察并计算穿模细胞数，实验重复3次。

1.9 裸鼠成瘤实验

选取4～5周龄雌性胸腺免疫缺陷SPF级15只裸鼠，体重14～17g，购于广西医科大学实验动物中心，本实验符合动物伦理学规定。取转染后并经嘌呤霉素筛选的THBS2-LV组、NC组以及空白对照组宫颈鳞癌SiHa细胞，扩大培养，于对数生长期收集细胞，用PBS重悬。15只裸鼠分为3组，每组5只，分别接种THBS2-LV组、NC组以及空白对照组宫颈鳞癌SiHa细胞，每只裸鼠接种量为1×107个细胞200 μL，注射于裸鼠腹股沟上脊柱旁皮下。于注射后7 d裸鼠皮下可触摸到结节，每3 d用游标卡尺测量瘤体长径（L）和短径（W），按照公式V（mm3）=（L×W2）/2 计算瘤体体积，并绘制曲线，于注射后第3周处死裸鼠，分离皮下瘤体，绘制瘤体生长曲线，实验重复3次。

1.10 统计学分析

采用统计学软件SPSS 17.0分析数据，计量数据以均数±标准差（±s）表示，两组比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，若组间差异有统计学意义，进一步的两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 荧光显微镜下观察细胞转染效率

转染慢病毒72 h后，在荧光显微镜下观察THBS2-LV组和NC组宫颈鳞癌SiHa细胞转染效率，可见两组表达绿色荧光蛋白的细胞占比均大于80%，可初步判定慢病毒成功转染宫颈鳞癌SiHa细胞，见图1。

图1 慢病毒转染宫颈鳞癌SiHa细胞的荧光及白光照片（×100）

2.2 转染过表达THBS2慢病毒后宫颈鳞癌SiHa细胞中THBS2 mRNA的表达

RT-qPCR检测结果显示，THBS2-LV组THBS2 mRNA的相对表达量为283 399.05±524 79.70，NC组和空白对照组分别为1.32±0.14和1.00±0.11，THBS2-LV组THBS2 mRNA的表达量较NC组和空白对照组显著升高，差异有统计学意义（P=0.003，0.003），NC组和空白对照组差异无统计学意义（P=0.765），见图2。

图2RT-qPCR检测宫颈鳞癌SiHa细胞中THBS2 mRNA的表达

2.3 转染过表达THBS2慢病毒后宫颈鳞癌SiHa细胞中THBS2蛋白的表达

Western blot实验结果显示，THBS2-LV组THBS2蛋白表达量为 1.45±0.19，明显高于 NC 组（0.87±0.20）和空白对照组（0.84±0.22），差异有统计学意义（P=0.003，0.002），NC组和空白对照组差异无统计学意义（P=0.825），见图 3。

图3 Western blot检测宫颈鳞癌SiHa细胞中THBS2蛋白的表达

2.4 转染过表达THBS2慢病毒对宫颈磷癌SiHa细胞增殖能力的影响

CCK-8法检测结果显示，THBS2-LV组、NC组和空白对照组OD值分别0.74±0.08、1.23±0.02和1.25±0.00，THBS2-LV组细胞生长速度明显低于NC组和空白对照组，差异有统计学意义（P＜0.001），NC组和空白对照组差异无统计学意义（P=0.765），见图4。

图4 转染后不同处理组宫颈鳞癌SiHa细胞的增殖能力

2.5 转染过表达THBS2慢病毒对宫颈磷癌SiHa细胞凋亡的影响

流式细胞仪检测结果显示，THBS2-LV组、NC组和空白对照组的细胞凋亡率分别为（21.40±1.20）%、（16.05±1.46）%和（13.91±2.62）。THBS2-LV 组细胞凋亡率高于NC组和空白对照组，差异有统计学意义（P=0.014，0.003），NC组和空白对照组差异无统计学意义（P=0.221），见图 5。

图5 转染后不同处理组宫颈鳞癌SiHa细胞的凋亡率

2.6 转染过表达THBS2慢病毒对宫颈鳞癌SiHa细胞侵袭能力的影响

Transwell侵袭实验结果显示，转染48 h后THBS2-LV组、NC组和空白对照组细胞穿膜数分别为（44.20±4.21）个、（71.80±5.63）个和（68.40±7.40）个，THBS2-LV组细胞穿膜数较NC组和空白对照组少，差异有统计学意义（P＜0.001），NC组和空白对照组差异无统计学意义（P=0.380），见图6。

图6 转染后不同处理组宫颈鳞癌SiHa细胞的侵袭能力（×200）

2.7 转染过表达THBS2慢病毒对宫颈鳞癌SiHa细胞迁移能力的影响

转染72 h后，THBS2-LV组的细胞迁移率为（51.01±7.40）%，NC 组和空白对照组分别为（71.05±8.40）%和（69.58±13.80）%。THBS2-LV 组细胞迁移率较NC组和空白对照组低，差异有统计学意义（P=0.014，0.009），NC组和空白对照组差异无统计学意义（P=0.824），见图 7。

图7 转染后不同处理组宫颈鳞癌SiHa细胞的迁移能力（×100）

2.8 裸鼠成瘤实验结果

THBS2-LV组成瘤率为80%，NC组及空白对照组成瘤率均为100%。第22天处死裸鼠，结果显示，接种THBS2-LV组细胞的裸鼠肿瘤平均体积为（218.26±72.44）mm3，明显小于接种NC组细胞裸鼠的肿瘤平均体积（416.96±88.46）mm3和接种空白对照组细胞裸鼠的肿瘤平均体积（403.64±103.12）mm3，差异有统计学意义（P=0.004，0.006），NC组和空白对照组差异无统计学意义（P=0.817），见图8、图9、表1。

表1 实验期间裸鼠皮下肿瘤体积的变化

图8 不同处理组裸鼠成瘤实验瘤体大体形态

图9 实验期间不同处理组裸鼠皮下肿瘤体积的生长曲线

3 讨论

中国每年新发宫颈癌病例占全球的五分之一［8］。近年来，人乳头状瘤病毒预防性疫苗的应用使宫颈癌得到有效预防［9］。手术和放疗可治愈大部分早期宫颈癌患者，但晚期和复发患者疗效不理想。分子靶向治疗为这类患者的治疗提供了新的思路，而寻找敏感的肿瘤标志物成为研究重点。

Bornstein等［10］于小鼠基因测序中首先发现THBS2，其为THBS蛋白家族中的一员，含有Ⅰ型重复区域结构，在抗血管生成中起重要作用［3，11］。近年在多种类型肿瘤研究中发现THBS2在癌组织中呈低表达，并影响肿瘤细胞的生物学特性。Sun等［5］在胃癌研究中发现THBS2在癌组织中呈低表达，而THBS2过表达的MKN-45细胞和SGC-7901细胞在软琼脂上形成更少集落，并促进SGC-7901细胞凋亡。Zhou等［12］在宫颈癌研究中发现miR-20a通过THBS2抑制细胞增殖并诱导细胞凋亡。Slavin等［6］研究发现前列腺癌组织中THBS2呈低表达，在癌相关成纤维细胞中敲低THBS2可中断雌激素受体α介导的细胞侵袭抑制。本课题组前期研究发现在宫颈鳞癌组织中mir-1246呈高表达，并促进细胞增殖、侵袭和迁移，且THBS2为mir-1246的靶基因［7］，以上研究提示THBS2可能是治疗宫颈癌的新靶点。为探讨THBS2对宫颈鳞癌SiHa细胞生物学特性的影响，本研究通过转染THBS2过表达慢病毒构建过表达THBS2的宫颈鳞癌SiHa细胞，RT-qPCR和Western blot实验结果显示，在转染过表达THBS2慢病毒的宫颈鳞癌SiHa细胞中THBS2 mRNA和蛋白的表达量明显高于转染空载病毒和正常培养的宫颈鳞癌SiHa细胞，说明本研究成功建立了稳定过表达THBS2的宫颈鳞癌SiHa细胞，可用于后续实验。

宫颈鳞癌细胞发生侵袭、转移是患者死亡率高的主要原因之一，研究其侵袭转移机制对改善患者预后有重要意义。本研究通过Transwell、划痕实验、流式细胞仪和CCK-8法观察细胞侵袭、迁移、凋亡和增殖能力，结果发现过表达THBS2的宫颈鳞癌SiHa细胞侵袭和转移能力较NC组和空白对照组明显降低，细胞凋亡率明显升高；其中细胞增殖率较NC组和空白对照组降低，与肺腺癌研究中下调THBS2可抑制A549细胞增殖的结论相悖，可能与肺腺癌免疫相关调节的特异性有关［13］，以上实验结果提示，在体外细胞实验中过表达THBS2可降低宫颈鳞癌SiHa细胞增殖、侵袭和迁移能力，且增强细胞凋亡能力。为进一步验证THBS2在宫颈鳞癌发生发展中的作用，本研究建立裸鼠模型，观察接种过表达THBS2慢病毒宫颈鳞癌SiHa细胞的裸鼠皮下成瘤情况，结果发现其皮下成瘤能力明显低于接种NC组和空白对照组细胞的裸鼠，且肿瘤平均体积明显缩小，与Calabro等［14］在裸鼠实验中的观察结果一致，说明THBS2可抑制裸鼠皮下宫颈鳞癌生长。可能的作用机制是THBS2具有备解素样Ⅰ 型重复区域结构，可作为血管生成抑制剂，通过对肿瘤血管生成抑制作用，阻止肿瘤发展和转移［15-17］。此外，THBS2抑制肿瘤进展的机制还可能与影响基质金属蛋白酶表达，以及参与TGF-β通路调控相关［18-19］。

综上所述，本研究在体外实验中发现上调THBS2表达可抑制宫颈鳞癌SiHa细胞增殖、侵袭、转移能力并促进其凋亡，同时在体内实验中验证过表达THBS2可抑制裸鼠皮下成瘤能力和肿瘤生长，THBS2可能是宫颈鳞癌的抑癌基因，可作为该疾病的潜在治疗靶点，具体作用机制有待进一步研究。