Fas/FasL与婴幼儿血管瘤演变过程的关联性研究

赵忠芳　张波　马少林

[摘要]目的：研究（Fas/FasL自杀相关因子，factor associated suicide/factor as sociated suicide lire）表达在婴儿血管瘤演变过程中每个阶段的表达量并探求它们之间的关联性。方法：选取在笔者医院保存的婴幼儿血管瘤病例标本60例，并依据标本所处血管瘤病理形态将其分成六个阶段，采用EnVi sion免疫组化法和RT-PCR方法检测Fas和FasL蛋白及mRNA的表达情况。结果：Fas蛋白在增生早期和中期时有部分表达量，在增生晚期时阳性细胞增多并且Fas mRNA表达量达到最大，从消退早期至晚期，Fas表达量呈下降趋势；FasL蛋白从增生中期开始出现表达，当到增生晚期时FasL mRNA表达量最大且FasL蛋白表达量达到最大，从消退早期到晚期，FasL表達量呈下降趋势。结论：Fas和FasL通过介导血管瘤细胞凋亡途径来使婴幼儿血管瘤自行消退，它们之间存在着密切联系。

[关键词]Fas；FasL；婴幼儿血管瘤；关系；演变

[中图分类号]R732.2 [文献标志码]A [文章编号]1008-6455（2017）07-0060-03

婴幼儿血管瘤是一种常见的儿童期皮肤肿瘤，男女发病比例为1：（3～5），多发于婴幼儿头面部并表现为刚开始快速增长但后期增长减慢最终又会部分自行消退。近年来，业内对于婴幼儿血管瘤自行消退的机制一直为研究热点，有学者已指出细胞凋亡途径可能就是其自行消退的主要原因，而且细胞凋亡途径中主要通路就是Fas/FasL蛋白介导的死亡受体通路。本研究通过对60例婴幼儿血管瘤标本进行检测，研究其Fas和FasL蛋白及mRNA的表达情况并找出其中的关联性，现报道如下。

1资料和方法

1.1一般资料：选取2010年1月2016年12月在笔者单位住院的婴幼儿血管瘤标本60例，所有入选的标本患儿均为未经过治疗且单纯进行手术切除制备石蜡标本，患儿年龄2～120个月，依据患儿病理标本的形态将60例标本分成6份，分别为增生早期、中期和晚期及消退早期、中期和消退晚期。增生早期6例标本，患儿年龄2～3个月；增生中期8例标本，患儿年龄4～6个月；增生晚期16例标本，患儿年龄7～12个月；消退早期标本10例，患儿年龄12～36个月；消退中期8例标本，患儿年龄36～60个月；消退晚期标本12例，患儿年龄60个月以上，所有标本均是石蜡包埋。

1.2方法

1.2.1免疫组化染色所需试剂：抗Fas和抗FasL抗体（北京中杉生物技术有限公司），隶属兔源性多克隆抗体；二抗：羊抗兔多聚酶标二抗，辣根过氧化物酶标记。

1.2.2 RT-PCR所需试剂：Fas、FasL和β-ActinPCR引物设计序列，如表1所示。合成公司，中科院上海生物工程中心；PCR Ex Taq酶反应系统，日本TaKaRa公司；抽提RNA和逆转录试剂盒SuperScript 1T，美国Gibco公司。

1.2.3免疫组化染色方法：实验前将标本用机器制成病理切片，约为4um厚度。对其进行Envision法免疫组化染色，各个免疫组化染色指标用PBS液作为阴性对照，将细胞胞浆内或细胞外基质中出现棕黑色或棕黄色物定义为阳性，其余为阴性。

1.2.4 RT-PCR：将标本进行总RNA抽提并逆转录合成cDNA，用PCR仪进行扩增，条件是90s94℃-30s50℃-30s72℃，总共30个循环，最后5min延伸时间，将扩增后的溶液进行琼脂糖凝胶电泳并对凝胶图进行吸光度值分析，每个样品均检测3次，计算公式如下：mRMA表达相对量=目的基因片段条带的吸光度A值/同一样本β-Actin条带的吸光度A值。

2结果

2.1免疫组化染色：通过表1可以看出，Fas蛋白在增生早期和中期时有部分表达量，细胞饱满、致密，部分细胞有棕黄色染色，且阳性细胞数目增多，在增生晚期时阳性细胞增多，但从消退早期至晚期，Fas表达量呈下降趋势，且微血管内皮细胞仍有微弱阳性染色；FasL蛋白的表达从增生中期开始，呈现少数阳性细胞，有的阳性细胞位于血管壁中，直到增生晚期时FasL蛋白表达量达到最大表达，阳性细胞增多，且均在细胞密集之处；从消退早期到晚期，FasL表达量呈下降趋势，直至几乎看不见阳性细胞。

2.2 RT-PCR：通过对Fas和FasL蛋白mRNA的电泳图进行观察，可以发现Fas mRNA在增生早期和中期有一定量表达，在增生晚期达到最高，进入消退期开始下降，等到消退完成其几乎检测不到，FasL mRNA从增生中期开始有少量表达并在增生晚期表达到最高，进入消退期仍然很高但在消退完成期又几乎检测不到，通过进行吸光度值分析可发现Fas和FasL蛋白的mRNA含量均是先升后降。增生早期、增生中期、增生晚期、消退早期和消退晚期患儿的临床表现，见图1。

3讨论

哺乳动物细胞凋亡主要通过死亡受体通路和线粒体通路进行，其中死亡受体途径主要涉及蛋白为Fas/FasL、caspase8和TNF等，线粒体途径主要涉及蛋白为easpase9、细胞色素C和BAX等，这两条途径都是通过caspase3来完成最终的细胞凋亡，有学者经过大量实验证明线粒体途径不会在血管瘤内皮细胞凋亡过程中发挥作用，因为在血管瘤中线粒体涉及蛋白均表达量低而且在增殖期和消退期均无明显变化差异，故死亡受体途径可能会在血管瘤细胞凋亡中发挥主要作用。CTL、Th1和NK细胞均会产生FasL，这些细胞数量增多和活性增强会促使细胞凋亡的发生，有文献表明T细胞和树突状细胞的数量在血管瘤增殖期和消退期中明显多于其消退晚期，在增殖早期婴儿血管瘤细胞中的CD3+、CD4+和CD8+数量比较少，但到了增殖中期这三个指标数量就显著增多，等到消退晚期这三个指标数量又显著下降，并通过对微血管壁进行观察发现上面有少数FasL+存在，说明其正在穿过微血管进入细胞团或者正与微血管壁细胞发生作用，故由此可以推出增生晚期细胞凋亡数量增多的原因是FasL的Tc和Th1的增多，所以说婴幼儿血管瘤演变的重要因素是Fas和FasL蛋白介导免疫和凋亡机制，其演变过程应属于肿瘤免疫范围。

婴幼儿的免疫状态也是其血管瘤细胞凋亡的一个重要影响因素，因为刚出生的胎儿其免疫系统尚未完全建立，其各种免疫细胞含量少，尤其由T细胞介导的细胞毒作用和树突状细胞功能弱或不完全，再加上此时婴幼儿不能通过胎盘获得母体的免疫因子，故胎儿出生后对外来和内在抗原的免疫应答能力低，近而容易诱发患儿出现血管瘤，而且有数据表明早产低体重儿血管瘤发病率极高，这都可以用新生儿免疫系统尚未发育完全来解释。随着婴幼儿免疫系统的建立逐步完善，T细胞开始分泌FasL和Fas受体促使婴幼儿血管瘤细胞凋亡并降低血管瘤生长速度。患儿早期血管瘤的微血管是由内皮细胞和周细胞包围形成，当患儿的体内免疫系统建立起来后T细胞通过识别周细胞并分泌大量FasL促使其凋亡，血管周围的周细胞数量在消退早期时会降至很低，而致敏性T细胞也使得血管瘤内皮细胞大量凋亡，这些均可以用来解释消退早期微血管迅速闭塞并消失的原因。

综上所述，Fas和FasL通过介导血管瘤细胞凋亡途径来使婴幼儿血管瘤自行消退，它们之间存在着密切联系。endprint