利用体外实验方法评估稻米中镉的生物可给性和健康风险

徐笠，刘洋，杨婧婧，栾云霞，陆安祥,*

1. 北京农业质量标准与检测技术研究中心，北京市农林科学院，北京 100097 2. 农产品产地环境监测北京市重点实验室，北京 100097 3. 盐城工学院环境科学与工程学院，江苏省环境保护海涂生态与污染控制重点实验室，盐城 224051

Cd是生物毒性最强的重金属元素之一，是最常见的重金属污染物[1]。1984年，联合国环境规划署将Cd列为具有全球意义的12种危害物质的首位，并于1993年被正式确定为致癌物质[2]。目前，Cd的人体健康危害日益受到人们的关注，Cd的环境迁移转化、人体暴露、健康效应以及风险评价等研究已经成为环境科学、地学及医学等领域研究热点之一[3-5]。随着我国现代工业和农业的高速发展，大量的人类活动使得Cd通过各种途径进入到农田生态环境中，对农田造成了严重的污染[6]。由于Cd的易迁移性的特点，农田土壤中的Cd会被作物吸收，从而通过土壤-作物系统进入食物链而危害人体健康[7]。稻米作为我国最主要的粮食作物之一，其Cd的含量及污染状况备受人们关注[8]。

从稻米中活化(溶解释放)出来进入胃肠道消化液中的污染物的比例被定义为其生物可给性(bioaccessibility)，该部分代表了稻米中Cd可能为人体所吸收的最大量[9]。胃肠道消化液中溶解态的Cd将会被肠道吸收，污染物(Cd)的人体生物有效性(bioavailability)被定义为人体肠道吸收后的污染物(Cd)的含量与摄入总量的比例[10]。动物模型活体实验是一种研究污染物的生物有效性的适用方法[11]，但是实验费用高、实验周期长、动物个体间差异以及伦理问题等缺点阻碍了其可以作为常用的生物有效性的评估工具[12]。因此，很多研究者开始通过体外(invitro)实验来研究污染物的生物有效性。近年来，由于invitro实验具有操作简单、费用低、重复性好以及结果较为准确等优点，受到国内外学者的广泛关注[13]，invitro实验结果反映的是稻米中Cd的生物可给性(bioaccessibility)[14]。目前，国内外对稻米中Cd的生物可给性的研究主要集中于生物可给性的研究方法、影响因素及其在人体健康风险评价的应用等方面，如Omar等[15]研究了品种对稻米中Cd的生物可给性的影响，Wang等[16]研究了蒸煮方式对市场上的稻米中Cd的生物可给性的影响。但我国对稻米中Cd的生物可给性方面的研究较少，特别是缺乏稻米中Cd的生物可给性与稻米理化性质之间的相关以及由于稻米摄入带来的健康风险的系统研究。本研究利用invitro方法，研究了湖南地区16个稻米样品中Cd的生物可给性及其人体健康风险，研究结果将丰富和发展稻米Cd的生物有效性的理论与方法，有助于准确判定稻米中Cd对人体的健康风险，为未来我国制定稻米中Cd的相关控制标准提供依据。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 稻米样品

研究所用的16个稻米样品中，稻米品种包括中早39、湘早籼24号、陵两优4024、株两优06、珍山一号以及丰源优272，采自湖南一些地区的农田。稻谷带回实验室后，65 ℃烘4～5 h备用，通过机器将稻米加工成大米样品，将部分大米样品过20目和40目筛，另将部分大米样品以1∶2(体积比)的米/水比蒸煮30 min，蒸煮过的样品匀浆机匀浆，冷冻干燥后，过60目筛用于稻米中Cd含量的分析和invitro实验，过20目筛的用于纤维的测定，过40目筛的用于蛋白和淀粉的测定。

1.2 稻米理化性质

蛋白：根据国标GB/T 6432—94，用全自动凯氏定氮仪测定(Kjeltec 8400，FOSS)；纤维：根据国标GB/T 6434—2006，用纤维素分析仪测定(Fibertec 2010，FOSS)；淀粉：蒽酮比色法，分光光度计测定(TU-1901, 普析通用)。稻米Cd总量采用HNO3和双氧水消解，消煮样品中包含试剂空白和标准植物样品(GBW10045，地球物理地球化学勘查研究所)，用以证实消解及分析过程中的准确性和精度，标准样品的回收范围是92%～105%。稻米Cd总量和模拟胃肠液样品中Cd含量的测定仪器为ICP-MS(NexION 350, PerkinElmer)。

1.3 in vitro实验

本研究使用的invitro实验方法主要基于Ruby等[17]提出的PBET方法，同时参考Rodriguez等[18]提出的IVG方法，并进行了改进。该实验方法由2个连续的invitro模拟阶段组成，即胃阶段和小肠阶段，具体操作步骤如下：

配制模拟胃酸液2 L(内含0.15 mol·L-1NaCl，柠檬酸1 g，苹果酸1 g，乳酸0.84 mL，冰乙酸1 mL)，用6 mol·L-1的浓盐酸将pH值调为1.5，加入胃蛋白酶2.5 g。将50 mL模拟胃液和0.5 g待测稻米样品分别加入溶出度测试仪(ZRD-8D，北研科研)的各反应器中，使反应器处于37 ℃的恒温水浴，100 r·min-1匀速搅动1 h，同时通入氩气1 L·min-1模拟肠胃的厌氧环境。然后用针筒吸取5 mL反应液，0.45 μm滤头过滤于塑料离心管中，保存在4 ℃冰箱中待测。之后，用ICP-MS分析待测液中的重金属含量。

小肠阶段用NaHCO3粉末将反应液的pH调至7，将胰酶0.0135 g、胆盐0.045 g加入每个反应器中，继续以1 L·min-1通入氩气，100 r·min-1匀速搅动。其间，每隔约30 min测定反应液的pH值，若偏离初始值，则用浓HCl和NaHCO3饱和溶液调节，使反应液pH值维持稳定。4 h后，吸取5 mL反应液，用0.45 μm滤头过滤于塑料离心管中，保存在4 ℃冰箱中待测。之后，用ICP-MS分析待测液中的重金属含量。

1.4 计算方法

(1)生物可给性

稻米中的Cd在模拟胃或小肠阶段的生物可给性可由公式(1)计算：

BA(%)=(C×V)/(CS×MS) ×100%

(1)

式中，BA为稻米中Cd的生物可给性；C为invitro实验胃阶段或小肠阶段反应液中Cd的可溶态含量(mg·L-1)；V为各反应器中反应液的体积(L)；CS为稻米样品中Cd的质量分数(mg·kg-1)；MS为反应器中的稻米样品的质量(kg)[19]。

(2)稻米中Cd的健康风险评估

稻米中的Cd每日暴露量由公式(2)计算：

ADD=Cm×Wc×BA/Wb

(2)

式中，Cm(mg·kg-1)为稻米中Cd的质量分数；Wc(kg·d-1)是每人每天消耗的稻米总量；BA是稻米中Cd的生物可给性；Wb(kg)为平均成年人体重。成人的体重为60 kg，儿童的体重为32.5 kg[20]。成人的每日稻米摄入量为389 g·d-1，儿童的每日稻米摄入量为277 g·d-1[20]。

联合国粮食和农业组织(FAO)/世界卫生组织(WHO)食品添加剂联合专家委员会建立Cd的参考剂量(RfD)为0.83 μg·kg-1·d-1。稻米中Cd的健康风险指数危害商(HQ)的计算方法如公式：

HQ=ADD/RfD

(3)

如果HQ>1，就证明有该稻米样品存在风险。由于人体的吸收主要在小肠部分进行，因此以小肠部分的生物可给性的结果计算健康风险。

1.5 数据分析方法

采用SPSS16和Excel 2010对数据进行分析。

2 结果与分析(Results and analysis)

2.1 稻米样品的基本属性

在湖南采集到的稻米样品中的Cd含量及基本理化性质都列于表1中。从表1中可知，样品中的Cd及基本理化性质的含量变化范围较大。蛋白含量的范围为69.7～99.3 g·kg-1，平均值为85.8 g·kg-1；纤维含量的范围为9.64～19.5 g·kg-1，平均值为13.6 g·kg-1；淀粉含量的范围为653.9～932.1 g·kg-1，平均值为821.6 g·kg-1。稻米中Cd含量的范围为0.14～2.24 mg·kg-1，平均值为1.00 mg·kg-1，根据我国稻米中Cd的限量标准(0.2 mg·kg-1)(GB 2762—2012)，在所有的16个样品中，有13个样品中的Cd含量超过国家标准。

2.2 稻米中Cd的溶解态及其生物可给性

稻米中Cd的溶解态含量及其生物可给性变化较大(表2)，胃阶段Cd的溶解态含量范围为0.102～1.70 mg·kg-1，平均值为0.698 mg·kg-1，Cd的生物可给性的范围为56.8%～82.0%,平均值为70.9%；小肠阶段Cd的溶解态含量范围为0.015～0.249 mg·kg-1，平均值为0.103 mg·kg-1，Cd的生物可给性的范围为6.62%～15.9%，平均值为11.1%。

表1 稻米样品的基本理化性质Table 1 Basic characteristics of the rice grain

表2 稻米中Cd的溶解态及生物可给性Table 2 Dissolved cadmium and bioaccessibility of cadmium in rice grain

2.3 各因素间关系分析

利用相关性分析方法分析了稻米中Cd全量、稻米理化性质、稻米中Cd的溶解态含量和Cd的生物可给性之间的相关关系，结果见表3。从表3中可知，G-D和I-D都与T-Cd显著相关(P<0.01)，G-D与I-D之间也是显著相关(P<0.01)，I-D与Fiber之间显著相关(P<0.05)，G-B与I-B之间显著相关(P<0.01)。

2.4 健康风险评估

表3 各因素之间的相关性Table 3 Correlations matrix for the factors

表4 稻米中Cd的健康风险评估Table 4 Health risk assessment of cadmium in rice

注：ADD为每日暴露量，单位为μg·kg-1·d-1; HQ为指数危害商。

Note： ADD is average daily dose, the unit is μg·kg-1·d-1; HQ is hazard quotient.

利用稻米中Cd的含量、人体(成人和儿童)可能摄入的稻米量、人体(成人和儿童)的体重、稻米中Cd的生物可给性以及FAO/WHO建议Cd的每日允许暴露量进行计算分析，获得成人和儿童通过稻米摄入途径Cd的每日暴露量及健康风险(表4)。从表4中可知，如果不考虑稻米中Cd的生物可给性，成人的ADD的范围为0.91～15.5 μg·kg-1·d-1，平均值为6.48 μg·kg-1·d-1，儿童的ADD的范围为1.10～20.4 μg·kg-1·d-1，平均值为8.52 μg·kg-1·d-1；如果考虑了稻米中Cd的生物可给性，成人的ADD的范围为0.10～1.61 μg·kg-1·d-1，平均值为0.67 μg·kg-1·d-1，儿童的ADD的范围为0.13～2.08 μg·kg-1·d-1，平均值为0.88 μg·kg-1·d-1。从表4中可知，如果不考虑稻米中Cd的生物可给性，成人通过稻米途径摄入Cd的HQ范围为1.10～18.7，平均值为7.81，儿童HQ的范围为1.41～24.0，平均值为10.0；如果考虑了稻米中Cd的生物可给性，成人HQ的范围为0.12～1.94，平均值为0.81，儿童HQ的范围为0.16～2.55，平均值为1.06。

3 讨论(Discussion)

3.1 稻米中Cd的溶解态含量及其生物可给性

不同稻米中Cd的生物可给性差异较大。本实验中，稻米中的Cd在胃阶段的生物可给性为56.8%～82.0%，在小肠阶段的生物可给性为6.62%～15.9%，小肠阶段Cd的生物可给性低于胃阶段Cd的生物可给性，这与前人研究结果一致[15-16]。Yang等[21]测定了某矿区稻米中Cd的生物可给性，结果表明：稻米中Cd的生物可给性的比例为16.6%左右。Wang等[16]研究了广州市场上的长粒米中Cd的生物可给性，结果表明：长粒米胃阶段Cd的生物可给性为64%，长粒米肠阶段Cd的生物可给性为4%。Omar等[15]研究了22种稻米中Cd的生物可给性，结果表明：22种稻米中Cd的溶解态的平均含量0.031 mg·kg-1。Zhuang等[22]研究了3种不同来源(市场购买、矿区采集和实验室种植)的稻米中Cd的生物可给性，结果表明：胃阶段Cd的生物可给性的范围为70%～74%，肠阶段Cd的生物可给性的范围为41%～46%。国内外一些学者还就其他食物中Cd的生物可给性做了一些研究，Hu等[23]研究了香港市售蔬菜中Cd的生物可给性，结果表明：9种蔬菜中Cd在胃和肠阶段的生物可给性分别为14%～71%和7.1%～25%，而Pelfrene等[24]研究表明：生的蔬菜中Cd在胃阶段的生物可给性为81%～89%，在肠阶段的生物可给性为63%～72%。这些研究结果表明：针对食物(稻米)而言，一般情况下，胃阶段Cd的生物可给性要高于肠阶段Cd的生物可给性，从胃阶段到肠阶段，pH的升高(pH值由1.5变为7.0)使得溶解的Cd发生沉淀或者再吸收的反应[25]，还有一种可能就是Cd与食物中的肌醇六磷酸形成了不可溶的化合物。不同食物甚至同一食物(稻米)中Cd的生物可给性具都有很大差异[26]，造成这一现象的原因可能是不同的体外消化方法造成的；也可能是由于不同稻米(食物)的营养成分差异大，从而导致了重金属生物可给性的差异。本研究也尝试分析稻米理化性质与稻米中Cd的生物可给性的关系，作了蛋白含量、纤维含量以及淀粉含量与稻米Cd的生物可给性的相关性分析，并没有显著相关。这表明，稻米Cd的生物可给性可能是受稻米中多种因素的共同影响。

3.2 稻米摄入导致的Cd的人体健康风险

稻米是我国最主要的粮食作物之一，全国有近三分之一人口以大米为主食，而且水稻本身也是一种易吸收Cd的农作物[27]。因此，越来越多研究者关注由于稻米摄入导致的Cd的人体健康风险。目前，仍有不少学者以稻米中Cd的全量来评估其人体健康风险，如Wang等[28]评估了湖南某地区稻米中Cd的健康风险，发现78%的稻米可对人体造成健康风险。然而稻米中的Cd在胃肠液中并不是都可以溶出的，利用生物可给性研究稻米中Cd对人体的健康风险，已经成为Cd对人体健康风险研究的重要方法之一。Wang等[16]以生物可给性的结果计算了广州市场上的长粒米的Cd的日暴露量，成人和儿童的日暴露量分别为38.6 μg·kg-1·d-1和29.4 μg·kg-1·d-1。Zhuang等[22]对3种不同来源稻米中Cd的生物可给性进行了研究，并以成人和儿童每日分别摄入389 g和277 g稻米评价了由于稻米Cd对成人和儿童的健康风险，结果显示为即使考虑了生物可给性，来自矿区的稻米Cd仍然会对成人和儿童造成健康风险。由于成人和儿童每日的稻米摄入量受到多种因素的影响，不同的研究者采用的摄入量不同，导致最终的结果差异也较大[29]。本研究中采用成人和儿童每日分别摄入389 g和277 g稻米，结果发现：如果不考虑生物可给性，那么所有的稻米的摄入都将导致人体(成人和儿童)健康风险。如果我们考虑了稻米中的生物可给性，将有5个稻米样品会对成人产生健康风险，将有8个样品会对儿童产生健康风险。从本研究结果来看，不考虑稻米中的Cd的生物可给性，将高估稻米中Cd的健康风险。因此，在今后评估稻米中Cd的健康风险的时候，应尽量考虑稻米中Cd的生物可给性。

综上：(1)采集的16个稻米样品，有13个稻米样品中的Cd含量超过了我国稻米中Cd的限量标准。稻米中Cd的溶解态及其生物可给性的值变化范围较大，模拟肠液中Cd的溶解态含量与稻米的纤维含量之间有显著的相关性。

(2)本研究所采集的稻米样品，如果不考虑生物可给性，那么所有的稻米的摄入都将导致人体(成人和儿童)健康风险。如果考虑了稻米中的生物可给性，只有31%(5/16)个稻米样品会对成人产生健康风险，将有50%(8/16)个样品会对儿童产生健康风险。

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