饮用水遗传毒性测试中TA98和TA100的敏感度和可靠度比较

张丽萍，刘文君

清华大学环境学院，北京 100084

随着环境污染的持续加剧，我国饮用水源和饮用水水质不可避免地受到影响。饮用水水质对人类健康的长期影响，特别是遗传毒性和致癌作用，越来越受到学者们的关注。许多研究表明，饮用水中的化学污染物能够增加某些肿瘤的发生，引起生物繁殖力的降低以及后代畸形的增加[1-4]。

自20世纪80年代将Ames试验用于饮用水以及水处理工艺出水的遗传毒性评价。在众多的遗传毒性短期试验方法中，Ames试验最为常用[4-5]。

用Ames试验评价浓缩水样的遗传毒性时，最常用的做法是采用TA98、TA100 2个测试菌株，分别在加或不加体外哺乳动物肝微粒体酶活化系统(简称S9)的条件下进行试验，每组试验采用至少3个不同剂量。虽然Ames试验的优点之一是操作简单[4]，但由于水源水、饮用水中有机物含量甚微，需要浓缩非常高的倍数才能达到Ames试验的检测灵敏度。通常需要富集几十升、上百升，甚至更多的水样，耗时长，工作量大。样品制备过程的繁琐成为制约Ames试验广泛应用的重要原因[5]。

为了研究工作的方便，国内外研究者希望简化Ames试验方法，在尽量不影响检测灵敏度的情况下，减少Ames试验的工作量和样品使用量。国内有研究者采用TA98、TA100 2个测试菌株不加S9的简化方法[6-7]，甚至有研究者采用更为简化的TA98一个测试菌株不加S9的方法[8,22,30]。国外研究者除采用TA98、TA100 2个测试菌株不加S9的简化方法外，还有采用TA98测试菌株加或不加S9的简化方法[9-10]。还有研究者将Ames试验由3个以上剂量梯度简化为只用一个剂量的点试验方法[11]。

不同地区水中的有机污染物质种类不同，对Ames试验测试体系的敏感度有差异。为了探讨适合我国水质的Ames试验简化方法，作者查阅了1985～2017年期间，我国研究者在科技期刊公开发表的用Ames试验评价我国水源水、水处理工艺出水及饮用水遗传毒性的相关文献80多篇，文献主要来自《中国知网》数据库，少量来自国外英文期刊[12-13]。摈弃其中Ames试验数据不详以及相同数据重复发布的文章，最终选择52篇文章进行Ames试验数据统计，共涉及480个水样(包括水源水、水处理工艺出水和自来水)，共计1 645个测试数据。根据文献数据统计和分析总结，作者提出了Ames试验在评价我国饮用水相关水样时的最佳简化方法。

1 Ames试验测试体系(Testing systems of Ames test)

Ames试验通常采用带有不同突变基因的一套菌株进行测试。根据研究结果发现，水中有机物质一般对TA98和TA100 2种试验菌株比较敏感，所以在测试饮用水时，Ames试验通常采用TA98和TA100 2种试验菌株[6]。另外，在Ames试验中，还采用体外哺乳动物肝微粒体酶系统(S9)来检测需要经体内代谢活化才呈现为致突变性的间接致突变物。因此，在评价水的遗传毒性时，常用的Ames试验通常包括4个测试体系：TA98-S9、TA98+S9、TA100-S9和TA100+S9，分别用来鉴定样品的直接移码型致突变性、间接移码型致突变性、直接碱基置换型致突变性和间接碱基置换型致突变性。

Ames试验测定水样遗传毒性时，样品对任何一个测试体系结果呈阳性反应，那么就判定该样品为致突变阳性。阳性结果通常以单位水样的致突变活性的高低来衡量遗传毒性的强弱。使用多个测试体系是为了防止样品致突变性的漏检。样品获得阳性的测试体系数量与样品的遗传毒性强弱没有直接关系。如果多个测试体系呈现阳性，以阳性最强的结果表征该水样的遗传毒性的强弱[6]。因此，如果能确定阳性最强的测试体系，则可以只使用一个测试体系，其他测试体系则可以省略，这也是寻求Ames试验简化方法的依据。

在采用Ames试验方法的52篇文献中，共涉及480个不同水样，统计结果列于表1。

从表1可以看出，在4个测试体系中，TA98-S9是使用率最高的。除1篇文献中4个样品只采用TA98+S9和TA100+S9测试体系以外[14]，其他51篇文献中，所有476个样品均采用TA98-S9测试体系。TA100-S9测试体系的使用率略低于TA98-S9测试体系，因为少数研究中，对部分水样简化为只用TA98-S9进行测试。TA98+S9和TA100+S9测试体系的使用率相近，低于不加S9的2个体系[8,22,30]。

在被统计文献中，共有38篇文献采用了上述4个测试体系对全部或部分水样进行Ames试验，除3篇文献未列出测试结果因而无法进行数据分析外[60-62]，其余35篇文献中289个水样列出了4个体系的全部测试结果，这部分数据被用于对不同测试体系进行比较，按文献发表时间顺序列于表2。其他14篇文献只采用了2个测试体系，甚至1个测试体系[7, 14, 27-30, 37-44]。将表2的结果整理计算后可得表3结果。

表1 Ames试验不同测试体系的使用情况Table 1 The use of different testing systems of Ames test

注：a文章使用率为在被调查文献中使用了该测试体系的文章数量占被调查文章总数量的百分比；b样品使用率为在被调查文献中使用了该测试体系的样品数量占被测试样品总数量的百分比。

Notes： a, usage rate by papers is the percentage ratio of the number of papers using this testing system to the total number of papers investigated; b, usage rate by samples is the percentage ratio of the number of samples using this testing system to the total number of samples in the investigated papers.

表2 使用4个测试体系的Ames试验测试结果Table 2 Testing results of Ames test using 4 testing systems

注：*最强阳性数为该测试体系测得阳性结果中致突变活性高于其他3个测试体系的数据数量；**额外阳性数为该测试体系测得最强阳性结果并且该样品用TA98-S9体系测试结果为阴性的数据数量。

Notes：*Number of maximum positive results is the number of positive results by this testing system whose mutagenic activity is stronger than those by the other three testing systems;**Number of extra positive results is the number of results that this testing system has the maximum positive result when TA98-S9 testing system has negative result.

从表3可以看出，TA98-S9测试体系的阳性率高达69%，TA98+S9测试体系的阳性率次之，达60%，而TA100-S9和TA100+S9测试体系的阳性率分别为22%和16%，说明水样对TA98菌株比对TA100菌株更敏感，而且在不加S9时，最为敏感。这与国内很多研究结论相一致[17,26,34]。

表2所列35篇文献中，涉及采用4个测试体系的289个样品，其中220个样品为阳性，69个样品为阴性。TA98-S9测试体系的阳性检出率和阴性可信度都是最高的，即阳性样品用TA98-S9测试体系测出阳性结果的概率高达91%，而其测出阴性结果的样品中有78%为真阴性，证明该测试体系的定性结果可信度很高。TA98+S9测试体系也具有较高的定性结果可信度。而TA100-S9、TA100+S9测试体系的阳性检出率和阴性可信度仅有20%～30%，证明其定性结果的可信度不高。

从最强阳性率的统计结果来看，4个测试体系的最强阳性率分别为66%、29%、4%、1%，亦即在阳性样品的定量评价中，TA98-S9测试体系的贡献率为66%，TA98+S9测试体系的贡献率为29%，TA100-S9、TA100+S9 2个测试体系对测定阳性样品的实际致突变性强度几乎没有贡献。

有效数据率表征该测试体系的测试结果在定量测定中的可信度，是定量试验中最值得关注的参数。采用TA98-S9体系，测得215个样品的致突变活性不低于其他3个测试体系的结果，即单独采用TA98-S9测试体系的有效数据率可以达到74%，显著高于其他3个测试体系。采用TA98+S9测试体系检出174个阳性样品，但是测得的致突变性普遍弱于TA98-S9体系，只有63个阳性样品测得的致突变性强于其他3个测试体系(包括8个额外阳性结果)，有效数据率约为46%。TA100-S9测试体系是使用率仅次于TA98-S9的测试体系，但是，采用TA100-S9测试体系只检出9个样品的致突变性强于TA98-S9体系(包括7个额外阳性结果)，即单独用TA100-S9体系仅可获得27%的有效数据率，有效数据主要来源于阴性水样，对测试结果的意义不大。至于TA100+S9测试体系，仅有2个样品测得的致突变活性强于其他3个测试体系[17,31](包括1个额外阳性结果[31])，对样品测试结果的影响几乎可以忽略不计。事实上，在35篇列出了TA100+S9体系测试数据的文献中，有25篇文章的测试结果全部为阴性。

从以上统计结果可以看出，在用Ames试验评价我国饮用水相关样品的遗传毒性时，TA98-S9测试体系最为敏感，也最为可靠，是定性、定量试验中都应该优先选用的测试体系，在已有研究中的应用也是最多的；TA98+S9测试体系的灵敏度和可靠性仅次于TA98-S9测试体系，在定性、定量试验中对TA98-S9测试体系可起到补充作用；阳性检出率和有效数据率仅次于TA98-S9，显著高于实际应用频率更高的TA100-S9测试体系，TA100-S9与TA100+S9 2个测试体系对Ames试验结果的影响几乎可以忽略。

导致上述结果的原因可以归为2个方面：一方面是因为TA98测试菌株比TA100更为敏感。单独使用TA98可检出83%的致突变物，将TA100和TA98结合使用可检出93%的致突变物[6]。另一方面的原因跟水中污染物的特性有关，一般认为水中致突变物以直接致突变物居多，并且氯化消毒过程增加直接致突变物，而在加入S9活化系统时其敏感性通常降低[6]。受不同工、农业污染以及不同水处理药剂的影响，不同地区的水源水和饮用水中的污染物种类有所不同，表现出的遗传毒性特征也可能有差别。一项针对全世界不同国家和地区地表水遗传毒性的文献调研发现[36]，TA98-S9、TA98+S9测试体系的阳性率皆为15%，TA100-S9、TA100+S9测试体系的阳性率皆为7%。与之对比可以发现，虽然TA98菌株比TA100菌株更敏感的结论是一致的，但我国水源水和饮用水相关样品表现出明显的特异性，TA98比TA100的阳性率高更多，而且加S9活化系统后敏感度降低。这也是建立适合我国饮用水特性的简化Ames试验方法的依据。

表3 Ames试验不同测试体系的测试结果对比Table 3 Comparison on the results of different testing systems of Ames test

注：1阳性率为该测试体系测出的阳性结果数占共测样品数(289个)的百分比，表征该测试体系对样品的敏感程度；2阳性检出率为该测试体系测出的阳性结果数占阳性结果总数(220个)的百分比，代表阳性样品用该体系测出阳性结果的概率，表征该测试体系阳性结果的定性可信度；3阴性可信度为阴性样品数(69个，用4个测试体系测得结果全部为阴性的样品数量)占该测试体系测出的阴性结果数的百分比，代表用该体系测出阴性结果而实际样品为阴性的概率；4有效数据数为该测试体系测得结果中致突变活性不低于其他3个测试体系的数据数量(阴性结果的致突变活性视为零)，即该测试体系的最强阳性数加阴性样品总数(69个)；5有效数据率为该测试体系有效数据数占共测样品数(289个)的百分比，表征该测试体系的测试结果在定量测定中的可信度。

Notes： 1 Positive rate is the percentage ratio of the number of this testing system’s positive results to the number of shared samples (which is 289), which shows this testing system’s sensitivity on samples; 2 Positive detection rate is the percentage ratio of the number of this testing system’s positive results to the total number of positive results (which is 220), which means the probability of positive samples be detected as positive results by this testing system, and shows the qualitative reliability of this testing system’s positive results; 3 Reliability of negative results is the percentage ratio of the total number of negative samples (the number of samples that were detected as negative by all four testing systems, which is 69) to the number of this testing system’s negative results, which shows the probability of real negative results when detected as negative by this testing system; 4 Number of effective results is the number of this testing system’s results whose mutagenic activity is not lower than the other three testing systems (the mutagenic activity of negative sample is considered as zero), which equals the sum of the number of this testing system’s maximum positive results and the total number of negative samples (which is 69); 5 Effective rate of results is the percentage ratio of the number of this testing system’s effective results to the total number of shared samples (which is 289), which shows the quantitative reliability of this testing system’s results.

2 Ames试验方法(Ames test methods)

文献调研发现，不同的测试者在研究中采用的Ames试验方法有所不同，有的采用了4个测试体系，有的只采用了2个测试体系，有的甚至只采用一个测试体系。我们将只采用TA98-S9测试体系的Ames试验方法称为方法1；将采用TA98-S9、TA98+S9 2种测试体系的方法称为方法2；将采用TA98-S9、TA100-S9 2种测试体系的方法称为方法3；将同时采用4种测试体系的方法称为方法4。从水样富集和Ames试验工作量来看，方法1的工作量最小；方法2和方法3的工作量次之，是方法1的2倍；方法4的工作量最大，是方法2和方法3的2倍，是方法1的4倍。

方法4是我国研究者采用Ames试验评价饮用水和水源水致突变性时最广泛使用的方法，与美国《水和废水监测分析方法》第20版中推荐的Ames试验方法相同。根据统计，52篇文献中有38篇使用了方法4，占文献总数的71%[8, 12-13, 15-26, 31-35, 45-62]。

有些测试单位认为水中的致突变物以直接致突变物为主，因此Ames试验仅采用TA98-S9和TA100-S9测试体系(方法3)[7, 27-30, 37-44]。采用方法3的文献有13篇，占被统计文献的25%；未发现只使用方法1的文献报道，仅在使用方法4的文献中有2篇[8,22]，方法3的论文中有1篇[30]对部分水样使用了方法1；方法2在国内被统计文献中未见报道，有国外研究者使用的报道[9-10]；另有1篇文献采用TA98+S9和TA100+S9 2种测试体系[14]。通过上述文献调研结果可以看出，试验菌株经体外代谢活化后，水样的致突变活性通常降低，不能确切反映水样的遗传毒性，因此只使用加S9测试体系的方法不科学，在此不作讨论。

图1 4种方法的阳性检出率Fig. 1 Positive detection rate of 4 methods

图2 4种方法的有效数据率Fig. 2 Effective rate of 4 methods

以方法4的致突变阳性检出率和有效数据率作为100%，根据表2的文献统计结果，可以计算出各文献中Ames试验如果分别采用4种方法的阳性检出率和有效数据率。如图1、图2所示，各图的最右侧一个数据代表35篇文献的汇总结果。从图中可以看出，只使用TA98-S9测试体系的方法1在大部分文献数据中可以获得较高的阳性检出率，汇总阳性检出率高达91%。在方法1基础上增加测试体系的方法2、方法3阳性检出率更高，但4种方法的汇总阳性检出率差别不大。因此，如果只定性评价水样的致突变阴、阳性而不关注致突变性的相对大小，推荐选用工作量最小的方法1，平均可获得91%的阳性检出率。

如果对水样的致突变性进行定量评价，需要考察Ames试验方法的有效数据率。从图2可以看出，4种方法的有效数据率顺序为方法4>方法2>方法3>方法1。虽然方法4的有效数据率最高，也是最为常用的Ames试验方法，但是其耗费的工作量和水样量也是最大的，成为限制Ames试验方法广泛应用的主要原因，这也是研究者试图寻求简化方法的原因。方法1仅用25%的工作量，即可获得74%的有效数据率，是非常经济而有效的方法。方法2和方法3的工作量相当，是方法4工作量的50%，但是方法2的有效数据率显著大于方法3，方法2的汇总有效数据率高达96%，而方法3仅为78%。与方法1相比，方法2增加TA98+S9测试体系使有效数据率提高了22%，而方法3增加TA100-S9测试体系仅使有效数据率提高了4%，说明TA100-S9测试体系对我国饮用水相关水样中的遗传毒性物质不敏感。

通过上述统计对比可以发现，虽然方法2未见文献报道，但与此前最常见的Ames试验简化方法3相比，有效数据率具有显著优势，用方法4一半的工作量即可获得96%的有效数据率，是用Ames试验评价我国饮用水相关水样遗传毒性时最合适的简化方法。在仅进行致突变性定性评价时，或者在测试费用、时间、水样量等条件受限制的条件下，推荐使用方法1，用25%的工作量可获得92%的阳性检出率和74%的有效数据率。

3 结论及建议(Conclusions and suggestions)

从国内研究者30多年来的试验结果可以得出，在用Ames试验评价我国饮用水相关样品的致突变性时，TA98-S9测试体系的敏感度和可靠度最高，TA98+S9次之，TA100-S9与TA100+S9 2个测试体系对Ames试验结果的影响几乎可以忽略。虽然使用TA98-S9、TA98+S9、TA100-S9、TA100+S9 4个测试体系的方法4是使用率最高和最可靠的Ames试验方法，也是美国《水和废水监测分析方法》中推荐的方法，但是该方法实验工作量大，样品制备、委托测试的费用不菲，不利于Ames试验的广泛推广应用。作者建议，研究者在用Ames试验评价我国饮用水、水源水以及给水处理工艺出水的致突变性时，可以使用TA98-S9、TA98+S9 2种测试体系的方法2，仅需50%的工作量，即可获得96%的阳性检出率和96%的有效数据率，适合广泛应用于科学研究和日常水质评价。采用TA98-S9测试体系的方法1仅用25%的工作量，可以获得91%的阳性检出率和74%的有效数据率，适合用于定性评价水样的致突变性，或者在测试费用、时间、水样量等条件有限的情况下也可用于定量评价。

致谢：感谢中国疾病预防与控制中心环境与健康相关产品安全所徐凤丹老师对论文工作的悉心指导！感谢清华大学孙文俊博士帮忙校对文稿！

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