HLA抗原特异性记忆B细胞在器官移植临床的应用

李代红，姚远，赵一贺（.天津市第一中心医院，天津 3009；.北京博富瑞基因诊断技术有限公司，北京 0076）

慢性肾功能衰竭（chronic kidney disease，CRF）是指由各种原因引起肾脏损伤，体积明显萎缩，且已不能维持肾脏基本功能的病症。CRF恶化至终末期时被称为尿毒症，此时药物治疗已无效，只有通过肾移植才能根治。目前我国有超过100万名尿毒症患者，但每年只有1万名患者可以进行肾移植手术，许多等待或不能进行肾移植手术的患者只能不断进行血液透析等替代治疗来延续生命，不少患者在等待肾源过程中死亡。面对我国如此稀缺的肾脏资源，如何通过优化肾脏资源选取，减少尿毒症重症患者肾源的等待时间，提高移植肾存活率，一直是临床医生最为关注的问题。

多年临床实践表明，大多数（＞80%）受体接受具有一个或多个人类白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）错配的移植物，其最终失败与产生针对错配供体HLA的供体特异性人类白细胞抗原抗体（donor-specific human leukocyte antigenalloantibodies，DSA）相关，其介导各类排斥反应，如超急性排斥反应、急性排斥反应、加速性排斥反应和慢性排斥反应［1-2］。近年来，随着新型强效免疫抑制剂的临床运用，肾移植的成功率明显提高［3］，但由HLA抗体介导的体液免疫排斥反应（antibody-mediated rejection，AMR）仍影响着移植后的人肾存活率。

随着检测技术的进步，HLA抗体的检测已由原来的补体依赖的微量淋巴细胞毒实验［4］（complement dependent cytotoxicity，CDC）、酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）［5-6］和流式细胞术［7-8］发展为现在的基于Luminex平台的微球分析法［9-10］，对HLA抗体检测的灵敏性已满足临床需求。近年来利用以上方法对受体外周血DSA的检测可以很好地预测移植后发生抗体介导的排斥反应和移植肾失功的风险［11-12］，但随着临床经验的积累和免疫学科的不断发展，不少学者认为受体DSA水平不能直接代表其免疫状态，因为其低估了记忆性B细胞对体液排斥反应的影响［13］。研究表明，当机体对某一蛋白抗原进行免疫响应时，将会同时产生浆细胞和记忆性B细胞。长寿浆细胞可以持续产生高亲和性的抗体结合抗原，给予机体免疫保护，当机体再次遇到相同抗原时，记忆性B细胞可以迅速分化成长寿浆细胞和短寿浆细胞，瞬间增加机体的特异性抗体浓度［14］。在器官移植中，有两种不同的情况，记忆性B细胞可能起关键作用：① 在慢性AMR的情况下，其中持续活化的记忆性B细胞导致与免疫抑制暴露不足相关的低度但进行性DSA形成，② 在高度致敏的患者中，接受含有先前由宿主识别的同种异体抗原的新移植物，从而触发快速且在抗原再次暴露后强烈的继发性DSA应答［15］。基于以上条件，我们发现供体特异性HLA记忆性B细胞对移植后抗体排斥反应的风险评估、优化受体肾源选择及减少受体等待时间具有重要的临床意义。

1 国内外研究现状

1.1 记忆性B细胞的研究进展：免疫记忆是高等脊椎动物获得性免疫应答的显著特征。体液免疫应答与细胞免疫应答是免疫记忆的两大分支。记忆性B细胞是一类具有记忆功能并持续存在于宿主体内的细胞，由成熟的初始B细胞通过抗原激活分化而来。当记忆性B细胞再次遇到相同抗原时，该细胞可迅速增殖并分化为浆细胞，以此产生高亲和力的抗原特异性抗体，介导体液免疫应答，保护机体免受再次入侵抗原的感染［14］。

体液免疫的基本功能是抗体产生和抗体记忆。在感染、接种疫苗或是输血、妊娠、移植后，通过B细胞受体（B cell receptor，BCR）对外来抗原的识别，成熟的初始B细胞会被激活，并分化为记忆性B细胞和浆细胞，使机体获得免疫记忆功能［16］。维持机体免疫记忆功能的细胞主要是记忆性B细胞和长寿浆细胞，且这种免疫记忆的维持是不依赖于抗原的［17］。长寿浆细胞定居于骨髓中，能够分泌抗体，低水平表达或不表达BCR，不能被刺激分化，也不能加速抗体产生。长寿浆细胞在抗原被清除后的一段时间内仍可以持续释放高水平的中和性抗体。记忆性B细胞则大部分在外周血中循环，小部分定居于次级淋巴组织和骨髓中，表达高亲和力的BCR，但不自主分泌抗体。研究表明，当机体再次接触相同抗原时，机体为了更有效清除入侵的非己物质，IgG+B细胞可被快速活化，并增殖分化为产生高滴度、高亲和力IgG抗体的分泌型细胞［16］。此外，记忆性B细胞除了分化为浆细胞产生抗体外，还可通过产生细胞因子或提呈抗原给T细胞，抵抗非己物质的入侵［18］。

在初次免疫应答期间，存在两种不同类型的记忆性B细胞在抗原再激发过程中表现出不同的功能：IgG+记忆性B细胞优先分化成浆母细胞，而IgM+记忆性B细胞增殖更多并进入生发中心反应［15］。

1.2 记忆性B细胞体外检测方法的研究进展：如何活化诱导记忆性B细胞在体外增殖是检测、研究其生理特性首先要面临的问题。因此，为精确评估HLA抗原特异性记忆B细胞在器官移植中的作用，需探索建立快速有效的B细胞活化方法。

经典的初始B细胞活化途径包括B细胞与抗原特异性结合以及抗原特异性T、B淋巴细胞的相互识别。但研究表明，记忆性B细胞的功能特性与初始B细胞存在差异，且活化方式也并不一致。因此，非抗原依赖的记忆性B细胞的活化增殖方案成为新的探索方向。研究发现，非抗原依赖的多克隆刺激剂CpG（cytosine-phosphate-guanine）、PWM（pokeweed mitogen） 和 SAC（staphylococcus aureus cowan）联合诱导记忆性B细胞分化为抗体分泌细胞（antibody-secreting cells，ASC）［19］。而对于多种细胞因子的联合应用，如CpG + CD40L +IL-2 + IL-10 + IL-15和R848 + IL-2的体外培养模型中，记忆性B细胞则更有效地分化为ASC，并分泌大量的IgM或IgG［20-21］。

目前已有多种使外周血记忆性B细胞增殖分化为ASC并产生相关抗体的成熟体外培养方案。但对于记忆性B细胞的活化却只是一种非特异性的多克隆激活方式，并分泌多克隆抗体［22-23］。如何从众多活化的记忆性B细胞中筛选出针对某种抗原的抗原特异性记忆B细胞依然是临床亟待解决的问题。此前，国外已有不少器官移植相关试验通过体外表达纯化的HLA抗原蛋白或用商业化的HLAⅠ类位点和Ⅱ类位点抗原混合物为抗原，通过酶联免疫斑点试 验（enzyme linked immunospot，ELISPOT） 检 测HLA抗原特异性记忆B细胞的含量［24-25］。ELISPOT法测量HLA抗原特异性记忆B细胞虽然灵敏度高，但操作较为繁琐，耗时较长，且只能检测患者是否存在HLA 抗原特异性记忆B细胞，并不能明确HLA抗原特异性记忆B细胞的HLA致敏位点。最近，随着Luminex平台技术的发展，HLA抗体检测试剂盒的不断成熟，国外已有实验室用商品化的HLA抗体检测试剂盒检测刺激培养后的记忆性B细胞上清中的抗HLA抗体含量［26］。此方法虽然灵敏度不如ELISPOT法，但操作简单、耗时小，且能准确知道HLA抗原特异性记忆B细胞的HLA致敏位点，现已被国外多家实验室接受。

但基于Luminex平台技术和HLA抗体检测试剂盒（Luminex-single antigen bead，Luminex-SAB）发展起来的HLA抗原特异性记忆B细胞的检测仍然存在以下缺陷：① HLA抗体检测试剂盒中的HLA抗原是体外合成的，未必能反映体内真实的抗原抗体结合反应；② HLA抗体检测试剂盒只能通过检测荧光强度大致反映患者由记忆性B细胞分泌出来HLA抗体的多少，既不能非常准确地分析检测样品中HLA抗体浓度也不能分析出样品中HLA抗原特异性记忆B细胞的数量，远不能达到定量分析患者体内HLA抗原特异性记忆B细胞的水平，较难作为临床诊断指标。

随着记忆性B细胞研究的进一步深入，荷兰莱顿医学院免疫血液及输血科建立了一种基于ELISPOT的定量检测供体特异性记忆B细胞的方法［27］。该方法主要通过植物血凝素（phytohaemagglutinin，PHA）刺激供体外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC），使PBMC持续分化，细胞中的HLA抗原含量上升，然后通过HLAⅠ类抗体和HLAⅡ类抗体获取供体HLA抗原。并利用这一供体特异性的HLA抗原与患者的记忆性B细胞进行孵育，最终通过ELISPOT方法定量检测出患者体内含有供体HLA特异性记忆B细胞的数量。通过这一方法检测患者的HLA抗原特异性记忆B细胞，无论是灵敏性、精确性还是可靠性都优于Luminex-SAB检测技术，但因为其要对供体细胞进行数日的诱导分化，使其在肾移植的临床运用受到限制，目前只能用于活体移植中。

2 HLA抗原特异性记忆B细胞在肾移植临床中的应用与前景

记忆性B细胞作为机体体液免疫的重要成员，在器官移植的免疫排斥反应中起到重要作用，国外不少实验室已开始对HLA抗原特异性记忆B细胞指标在肾移植中的临床应用进行了研究。

巴塞罗那医学院肾脏内科对10例肾移植术后发生AMR的患者进行回顾性分析发现［28］，其中5例患者术前外周血群体反应性抗体（panel reactive antibodies，PRA）检测为阴性，5例患者为可疑阳性。但当他们利用Luminex-SAB方法检测患者HLA抗原特异性记忆B细胞时发现，9例患者都显示为阳性。该回顾性试验表明，患者外周血HLA抗体含量可能受患者当时免疫状态或免疫抑制剂等影响，含量变化较大，其浓度不能等同于患者此时相对应HLA抗原的免疫状态。而HLA抗原特异性B细胞作为HLA抗体的上游细胞，能更为准确地预示患者针对于特定HLA位点发生排斥反应的风险。 进一步对等待移植患者血清HLA抗体和记忆性B细胞的检测发现，30.8%（42/136）HLA抗体MFI＜1 500的患者，体内均存有HLA抗原特异性记忆B细胞。

荷兰莱顿大学医学院输血及免疫科对39例肾移植术前PRA阳性的患者进行分析［26］，研究发现，抗原特异性记忆B细胞的出现与患者所经历的免疫事件大小与次数相关。如只接受过输血的患者，虽然体内预存有HLA抗体，但只有较少几率产生HLA抗原特异性记忆B细胞，而只经历过妊娠或移植的患者，产生HLA抗原特异性记忆B细胞的几率也不高于60%，但当患者同时经历过输血、妊娠及移植，则几乎必然会产生HLA抗原特异性记忆B细胞。另外，相关的临床研究表明，利用HLA抗体检测试剂盒测量患者外周血PRA时，因为入侵物抗原与HLA抗原相近等原因，获得的假阳性位点较多，不利于肾源选择，但利用Luminex-SAB法检测患者HLA抗原特异性记忆B细胞时，出现的HLA阳性位点较少，且HLA阳性位点均具有相同的致敏表位，利于供体肾源的选择。以上临床结果对我院肾移植专科的临床指导意义重大，每年在我院等待肾移植患者中，PRA阳性患者高达100人，这类患者往往等待肾源的时间较长，还有部分PRA高阳性患者因为等待不到合适的肾源而死亡。如果部分PRA阳性患者只单独接受过输血，其产生抗原特异性记忆B细胞几率较少，术前可以只需接受血浆置换或免疫吸附将HLA抗体浓度降低到安全水平即可，不需过分考虑肾源的配对问题，大幅度降低患者等待肾源的时间。但以上结论获得所依赖的病例数较少，且外周血PRA检测阳性而记忆B细胞上清PRA检测阴性的HLA位点是否会给移植带来排斥反应的风险，还需要进一步的临床试验去验证。

综上所述，近几年来国外多个肾移植实验室已陆续开展HLA抗原特异性记忆B细胞相关的临床试验。现已表明，抗原特异性记忆B细胞在优化肾源选择，预示术后排斥风险上具有重要的临床意义。但其研究和运用时间尚短，还需要更多的临床病例信息明确术后患者产生AMR是否与其预存HLA抗原特异性记忆B细胞相关，明确记忆性B细胞是否在肾移植各阶段含量是否稳定，是否可以作为一个稳定指标指导临床诊断，明确输血、妊娠、移植等免疫事件对HLA抗原特异性记忆B细胞产生的关系。最终为我们进一步运用抗原特异性记忆B细胞作为临床指标提供理论依据。