胰酶消化时长对GFP转基因小鼠BMSC传代生长特性的影响

和法莲，白盈盈，陈慧芬，李自安，杨建勇，潘兴华，刘高米洋

绿色荧光蛋白（GFP）转基因小鼠的骨髓间充质干细胞（GFP-BMSC）具有自我更新和多向分化潜能，同时又能稳定表达GFP，可作为骨髓间充质干细胞（BMSC）体内示踪及分化研究的良好工具。笔者的前期研究发现，体外分离培养中小鼠GFP-BMSC的培养不同于人及大鼠，其培养扩增难度高，细胞活性保持时间短，传代过程中BMSC消化时间长短难以控制，严重影响小鼠GFP-BMSC的体外扩增效率。本研究通过比较不同胰酶消化时间对消化过程的影响，优化小鼠BMSC消化时间，为小鼠BMSC的后续研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物与材料 4～8周龄雄性绿色荧光蛋白转基因小鼠，由医院动物中心提供，实验方案经动物实验伦理委员会批准；DMEM/F12培养基(美国BI公司)、胎牛血清（Hyclone公司）、SW-CL-2F 型百万层级层流超净工作台(苏州佳宝净化工程设备有限公司)、二氧化碳培养箱(美国Thermo公司)、倒置相差显微镜(日本奥林巴斯公司)、0.25% 胰酶(美国BI公司)，成脂、成骨、成软骨诱导试剂盒（GIBCO公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 BMSC的提取和培养 脱颈处死绿色荧光蛋白转基因小鼠，75%乙醇皮肤消毒，无菌条件下取股骨及胫骨，浸泡在PBS中，移至超净工作台，移除PBS，再用含双抗1∶100的PBS清洗3遍。用无菌剪剪掉两侧的骨骺端，暴露骨髓腔，放于10 mm培养皿中，用1 ml一次性注射器吸取细胞培养基(含10%FBS的DMEM/F-12)冲洗骨髓腔。冲洗数次直至将绝大部分骨髓冲出，骨髓腔由红色变成白色为准。用5 ml一次性无菌巴氏滴管，反复在培养皿中吹吸细胞悬液3～5次，尽量使细胞呈单个状态；再全部转移到新的10 cm2培养皿中，置于培养箱中培养，此时细胞悬液约5 ml，24 h后补液至10 ml。待细胞融合率约80%～90%时传代。

1.2.2 胰酶最佳消化时间确定 取P2代纯化的含相同细胞量的小鼠BMSC悬液接种于6孔细胞培养板中，待细胞生长融合度达到80%～90%时，用0.25%的胰酶消化 5、10、15和 20 mins，观察细胞消化程度、细胞形态、死亡细胞碎片的数量，比较不同时间点胰酶对小鼠BMSCs的消化能力。

1.2.3 BMSC诱导分化潜能鉴定

1.2.3.1 成脂诱导 取消化10～15 mins后再次贴壁的P3代小鼠BMSC，按2×104个/cm2的密度接种6孔板中，加入20%FBS的DMEM/F12完全培养基2 ml/孔。将细胞置于5%CO2培养箱中培养，每隔3 d换液，直到细胞融合度达到100%或者过融合。弃上清，加入成脂诱导液，每3 d换1次液。成脂诱导分化结束后，4%中性甲醛溶液固定，油红O染色，观察成脂染色效果。

1.2.3.2 成骨诱导 取消化10～15 min后再次贴壁的P3代小鼠BMSC，按2×104个/cm2的密度接种在6孔板中，将细胞置于5%CO2培养箱中培养。每隔3 d换液，直到细胞融合度达到60%，弃上清，加入成骨诱导液，每3 d换1次液；培养至21 d后，4%中性甲醛溶液固定，茜素红染色，用1×PBS冲洗3次。将培养板置于显微镜下观察成骨染色效果。1.2.3.3 成软骨诱导 取消化10～15 min后再次贴壁的P3代小鼠BMSC，按5×105个/cm2的密度接种在6孔板中，将细胞置于5%CO2培养箱中培养，贴壁2 h后，弃上清，加入成软骨诱导液，每3 d换1次液，培养诱导14～28 d后，对软骨球进行福尔马林固定和石蜡包埋，进行阿辛蓝染色，显微镜下观察。

2 结果

2.1 BMSC分离培养结果 采用全骨髓贴壁培养法分离的小鼠BMSC，接种3 d后，可见大量贴壁细胞生长，呈梭形，上层培养基中悬浮大量的杂细胞；弃上层培养后，并用PBS缓冲液冲洗2遍后，自然光与绿色激发光下，可见形态均一的细胞增殖集落(图 1a、b)；继续培养 2～3 d，75%以上细胞融合。 经胰酶消化后1:2传代，自然光与绿色激发光下，细胞贴壁后呈典型的成纤维细胞形态(图1c、d)，分布均匀，大小一致。

2.2 不同时间点胰酶消化结果 胰酶消化5 min后，大量细胞仍处于贴壁状态，无法传代(图2a)；胰酶消化10～15 min后，50%～80%细胞缩成圆形，不再贴壁，可用于传代，显微镜下细胞呈单个状态，死亡碎片较少，且二次贴壁后细胞呈长梭形，表面光滑，具有多向分化潜能(图2b、c)；胰酶消化20 min后，细胞大部分悬浮，传代再贴壁后细胞呈宽大扁平状，表面粗糙，状态较差(图2d)。

2.3 BMSC诱导分化能力 体外成脂分化诱导14～21 d后，细胞由长梭形开始收缩、变圆，形态不规则，有脂肪小滴，经油红O染色后，脂滴明显红染（图3a）；体外成骨分化诱导 14～21 d后，经茜素红染色后，出现明显红染的钙结节（图3b）；体外成软骨分化诱导14～28 d后，石蜡包埋切片，可见软骨胶原基质中酸性粘多糖经阿利新蓝染成蓝色（图3c）。

3 讨论

图1 倒置显微镜观察小鼠荧光BMSC的形态（40×）

图2 荧光小鼠BMSC的胰酶消化后的贴壁形态（40×）

BMSC是干细胞研究中的一个重点和热点，因其含量相对较多又易于获得，体外生长能力强，已被广泛用于人类疾病动物模型治疗研究，但在体内示踪其迁移、分布、定位及分化困难。绿色荧光蛋白标记技术是近年来细胞标记的主要技术[2]，但GFP慢病毒转染标记的细胞，其GFP表达存在实效性极不稳定、易荧光淬灭的缺陷，而GFP-BMSC具有绿色荧光蛋白表达稳定、免疫原性较低等特性，为干细胞体内示踪提供了良好的条件[3-4]。建立完善的GFP转基因小鼠BMSC的培养体系，是获得GFPBMSC并用于相关研究的前提和基础。

图3 小鼠BMSC诱导潜能结果

人类和大鼠BMSC在传代过程中，可以用0.25%胰酶消化2 min左右便可使细胞脱落[5-6]，而GFP小鼠的BMSC胰酶消化时间尚不确定，胰酶消化时间过短，GFP-BMSC难以自动脱落；而消化时间过长，胰酶过度与细胞接触，可破坏细胞表面蛋白和细胞双层膜，导致细胞破坏、甚至死亡。本实验结果发现，在胰酶消化5 min时，大部分细胞处于贴壁状态，只有少量细胞悬浮，不符合细胞传代要求；在胰酶消化时间为20 min时，细胞全部脱落，但是二次贴壁后，细胞死亡碎片较多且细胞形态不一，不成梭形，不满足干细胞的形态；而在胰酶消化时间为10、15 min时，大部分细胞变成圆形、脱落，符合传代要求，且二次贴壁后，细胞状态良好、呈梭形，具有BMSC的基本形态，诱导分化结果显示具有成脂、成骨、成软骨的诱导分化能力。结果说明，用胰酶消化10～15 min不会破坏 GFP-BMSC的细胞形态、传代生长特性及分化能力。

综上所述，0.25%胰酶与底物GFP-BMSC的最佳消化时间是10～15 min。相比于人和大鼠消化只需要2 min而言，GFP-BMSC的消化时间是其5～8倍，这一现象可能与其种属遗传特性及转GFP基因有关，但详细机制有待于进一步研究。

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