MicroRNA和雪旺细胞自噬与周围神经再生修复的研究进展*

高 群， 宁昕杰， 王 辉

(中山大学附属第三医院神经外科， 广东 广州 510630)

周围神经损伤会使神经支配区域的运动、感觉机能下降和缺失，严重影响生产和生活质量。现代显微外科技术的应用已大大提高了修复效果，但由于周围神经的特殊结构和功能，目前的修复技术对于神经功能的恢复效果仍然有限，这引起了研究者们对于周围神经损伤后再生修复机制的探索。周围神经损伤后，损伤处残存雪旺细胞(Schwann cells)的数量和增殖分化能力是影响神经再生修复的关键因素[1]。在周围神经损伤后的雪旺细胞内发现大量溶酶体反应阳性的产物，其成分是包裹损伤细胞器和多余蛋白质的自噬体。而随着分子生物学的不断发展与进步，越来越多的研究发现微小RNA(microRNAs, miRNAs)在神经再生修复过程中起着重要的调控作用，神经损伤后，miRNAs参与调控神经再生过程中雪旺细胞的增殖和分化活动[2]。而我们的近期研究发现在神经损伤早期雪旺细胞发生的自噬现象中，miRNAs也发挥着重要的调控作用。因此，本文将对雪旺细胞自噬以及miRNAs与神经再生修复过程中的关系进行综述。

1 自噬对周围神经再生修复的双重作用

1.1自噬的简介 自噬现象广泛存在于真核细胞中，是指细胞利用双层膜结构包裹胞浆内受损、衰老的细胞器或异常蛋白，通过溶酶体途径降解、清理，释放出游离小分子供细胞回收利用的动态循环过程[3]。在哺乳动物中，根据底物的特点、转运类型及调控机制的不同，自噬可分为分子伴侣介导的自噬、微自噬和巨自噬。分子伴侣介导的自噬仅存在于哺乳动物细胞中，胞浆中分子伴侣(如Hsc70等)可以选择性识别可溶性蛋白分子的特定氨基酸序列并与之结合，通过膜转位进入溶酶体腔，分解为氨基酸等被细胞再利用；胞内物质(如长寿蛋白等)直接被溶酶体膜内陷吞噬形成膜泡，并在溶酶体内降解的过程为微自噬；巨自噬是胞浆中的可溶性蛋白质和变性坏死的细胞器被非溶酶体来源的双层膜结构包裹形成自噬体，自噬体再与溶酶体结合，包裹物被溶酶体分解成可供细胞利用的氨基酸、核苷酸等小分子物质的过程。巨自噬是哺乳动物中最常见和最重要的自噬方式，目前对自噬的研究主要集中在巨自噬，其分子机制也最为清楚[4]。自噬体的形成是细胞发生自噬的关键步骤，这一复杂过程主要涉及5个关键环节：(1)自噬诱导：自噬诱导是自噬体形成的起始阶段，它与自噬相关基因1(autophagy-related gene 1, Atg1)/ULK复合物形成有关；(2) 囊泡核化：主要是beclin-1与磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)复合物的激活，该复合物在自噬体形成的起始阶段起重要作用[4];(3)囊泡延伸：依赖2个泛素样结合系统Atg12-Atg5·Atg16 和Atg8/微管相关蛋白 1A、1B-轻链3(light chain 3, LC3)而发挥作用；泛素激活酶E1(Atg7)在2个复合物形成的过程中发挥重要作用[4-5];(4) 脂质转运：嵌膜蛋白Atg9及其它相关蛋白协同转运脂质，同时募集其它嵌膜蛋白；(5)自噬体与溶酶体融合：自噬体及其内容物被水解酶降解消化[6]。

研究发现，除了饥饿、缺血、缺氧等能量相关因素发生改变外，内质网应激、模式识别受体的激活、细胞因子的缺乏以及放、化疗等都可成为自噬的诱因[6-7]。自噬具有两面性，一般情况下自噬是一种广泛存在的生理过程，有利于细胞应对不良环境；某些情况下由于自噬的非特异性，又会对机体产生不利的影响[4]。机体感染链球菌后，通过自噬可以有效地吞噬降解细菌；而如布鲁氏菌则依靠自噬的包裹实现自我复制，进而出现“波状热”。在肿瘤发生的早期，自噬可以阻碍肿瘤的进展，而在中晚期自噬协助肿瘤细胞应对缺血、缺氧不利条件，有助于肿瘤的发展、转移。总之，自噬在神经系统疾病、肿瘤、免疫以及凋亡过程中发挥重要作用，贯穿于细胞的生长发育和病理生理的全过程[7-8]。

1.2自噬通过调节雪旺细胞稳态影响周围神经再生 周围神经损伤后, 损伤处以及损伤远端由于缺乏神经元胞体的营养供应发生华勒变性[9]，表现为轴索中断并坏死，髓鞘崩解消失。雪旺细胞作为周围神经系统的重要组成细胞，在损伤神经再生修复中发挥着清除损伤处的髓鞘碎片形成 Bunger带、分泌神经营养因子以及引导轴突的再生等不可替代的作用[10-11]。自噬作为调节细胞稳态的一种重要机制，能够使雪旺细胞度过应激期，为雪旺细胞的数量、增殖分化提供保障，从而成为影响神经再生的关键环节。

1.2.1自噬有利于雪旺细胞清除神经损伤处髓鞘碎片 周围神经损伤后，再生修复的首要过程是清除髓鞘碎片，在损伤后的5～7 d，雪旺细胞的自噬作用可清除40%～50%的髓鞘碎片，接下来，巨噬细胞通过与抗体和补体结合介导的吞噬作用对髓鞘碎片进行清除。研究者通过观察CCR2-/-小鼠(该类小鼠中巨噬细胞不再产生对吞噬作用有意义的聚集)，7 d之后的神经损伤处髓鞘碎片被正常清除，从而进一步强调了雪旺细胞自噬对髓鞘碎片清理的重要性[12]。

在小鼠实验中，通过敲除Atg7抑制雪旺细胞的自噬作用，或者利用药物作用于溶酶体干扰自噬流，不仅会影响神经纤维的崩解，还会减少巨噬细胞聚集，延缓了髓鞘碎片的清除以及神经再生的进程。自噬过程正常的小鼠，其损伤后轴突再生及髓鞘化程度明显好于自噬相关基因缺失或药物抑制自噬的小鼠[13]。

1.2.2自噬有利于神经损伤后雪旺细胞分化 自噬还有助于雪旺细胞的去分化过程，促使雪旺细胞向增殖状态转变，抑制自噬的同时可能会抑制雪旺细胞的增殖迁移能力[14]。进一步研究发现，雪旺细胞主要通过细胞外信号调节激酶的激活和JNK/c-Jun通路的诱导实现脱分化；研究者利用JNK/c-Jun通路的激活剂神经酰胺或氯化锂处理受损神经后，雪旺细胞自噬现象显著增高；而通过饥饿以及雷帕霉素诱导哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)通路诱导神经断端雪旺细胞，发现自噬现象无明显改变[12]。

也有研究表明，通过制造大鼠坐骨神经挤压伤的模型，腹腔连续注射一定量的雷帕霉素后，电镜观察神经损伤处自噬体较对照组显著增多；而注射3-甲基腺嘌呤后，自噬体数量明显减少。这一研究结果表明自噬经典通路mTOR通路同样可以增强损伤处雪旺细胞的自噬，并且诱导自噬增强之后，大鼠运动功能恢复情况明显好于对照组[15]。

1.2.3自噬可以促进雪旺细胞分泌神经营养因子(neurotrophic factors, NTFs) Chen等[16]研究表明小鼠坐骨神经离断后，在神经断端远侧端，ULK复合物、Atg7、Atg9等自噬体形成的基本组分明显的增高，从而进一步证实神经损伤后雪旺细胞内有自噬的发生。在神经损伤后，雪旺细胞分泌多种神经营养因子与细胞外蛋白，能够促进神经纤维的再生;而抑制自噬的发生会削弱雪旺细胞分泌神经营养因子，继而影响后续神经再生过程。

1.3自噬压的升高不利于神经再生修复 在正常的生理情况下，自噬体的形成与分解维持一个动态的平衡，而当自噬体形成过多或溶酶体降解过程受损时，自噬体的形成超过其分解量，从而导致自噬体的蓄积，这种自噬体的正向积累称为自噬压[17]。由于神经细胞特殊的结构特点，自噬体形成后要通过微管运输到溶酶体才能完成分解，诸多病理生理情形,例如短时间内损伤胞器或异常蛋白质大量积累、微管转运受阻或自噬体与溶酶体结合受损、溶酶体水解酶异常等均可导致自噬体累积，使自噬压升高。在阿尔茨海默病患者脑的神经轴突中含有大量累积的自噬泡，提示自噬泡转运的障碍以及与溶酶体结合的受阻，自噬泡的累积及降解障碍导致淀粉样蛋白的蓄积，进而引起神经退行性变[18]。神经细胞对自噬压升高的反应非常敏感，细胞内环境随增高的自噬压改变，正向增强自噬作用，致使神经细胞凋亡崩解，从而对多种神经系统疾病产生影响，如帕金森病、阿尔茨海默病以及由于雪旺细胞过度自噬引起的周围神经疾病等[17]。

2 miRNAs对周围神经再生的调控作用

2.1miRNAs简介 miRNAs是一类具有调控功能的单链非编码小分子RNA，长度约为22个核苷酸，具有生物间高度保守性和基因簇集性的特点[19]，主要介导转录后调控机制，对生物的生长、发育等过程发挥着重要作用。miRNAs通常位于蛋白编码基因的内含子区，在核内由RNA聚合酶II转录，初产物为pri-miRNA。Pri-miRNA在III类RNA酶Dorsha及其辅助因子作用下被处理成发夹状pre-miRNA，随后核酸酶Dicer将pre-miRNA剪切为22个核苷酸大小的双链RNA产物，这个双链RNA的引导链与Argonaute蛋白形成沉默复合体(RNA-induced silencing complex, RISC)，另一条随从链自行降解[20]。目前在哺乳动物中大约有1 400种miRNA存在，参与大约60%蛋白编码基因的调控[21]。目前研究发现miRNAs主要通过与靶基因3’端非翻译区(3’-untranslated region，3’-UTR)以完全或不完全互补结合的方式发挥作用，阻遏翻译过程或裂解靶mRNA，抑制基因表达，实现对基因转录后表达的调控[2]。

2.2miRNAs参与周围神经再生修复的调控 miRNAs对于雪旺细胞的生长至关重要，miRNAs缺乏的雪旺细胞不能脱分化为未成熟状态。研究者利用基因敲除技术，敲除小鼠雪旺细胞中miRNAs合成所必须的关键酶Dicer，观察髓鞘再生过程，首次证实神经再生过程中需要miRNAs的参与[22]。近年来，研究表明，miRNAs在受损神经处的雪旺细胞中表达异常，引起多个基因的表达变化，从而调控雪旺细胞的分化、分泌等行为。有研究证实，大鼠坐骨神经损伤后，损伤处神经组织中多种miRNAs表达特异性增高[23-24]。

2.2.1miRNAs的表达有利于雪旺细胞存活和迁移 已有的研究证明，人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因(phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10,PTEN)通过使3，4，5-三磷酸磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate, PIP3)的去磷酸化，实现细胞生长的抑制和促进细胞凋亡，而高表达miR-21可以下调PTEN的表达，减少雪旺细胞的凋亡，从而有利于周围神经修复再生[25]。该研究表明在神经受损后，雪旺细胞中的miRNAs对于雪旺细胞的再生具有重要的调控作用[2]。

在体外实验中，提高miR-221/222的表达可以促进雪旺细胞的增殖和迁移，而沉默它们的表达则会抑制增殖和迁移，研究证实miR-221/222是通过与长寿保障基因2(longevity assurance homologue 2,LASS2)的3’端的UTR结合，抑制LASS2的表达，提高了雪旺细胞的增殖和迁移能力[26]。神经损伤后，若抑制miR-9的表达，则会通过调控胶原三股螺旋重复蛋白1(collagen triple helix repeat-containing protein 1, Cthrc1)靶基因，阻止Rac1 GTPase的激活，促进施万细胞的迁移[27]。

周围神经损伤后，miR-21在雪旺细胞中高表达，并通过靶基因转化生长因子β诱导蛋白介导G1/S-特异性细胞周期蛋白D1(cyclin D1, Ccnd1)的表达，进而调控雪旺细胞的增殖生长[28]，揭示了周围神经损伤后雪旺细胞增殖的新机制。

2.2.2miRNAs可以促进雪旺细胞的分化 周围神经损伤后，miRNAs通过转录后调控机制调节雪旺细胞的脱分化与再分化,实现了其在神经再生修复中的关键作用。脱分化后的雪旺细胞通过增殖可以重新恢复受损的髓鞘，形成轴突再生的通道并且引导轴突再生进入靶组织[26]。miRNAs在雪旺细胞由髓鞘前阶段向成髓鞘阶段转变过程中起关键作用，研究发现Dicer的缺失使大多数雪旺细胞分化停滞在成髓鞘前阶段，表现出在不同分化状态转换间的一种延迟[29]，小鼠周围神经损伤后，雪旺细胞的脱分化与再分化的调节主要是通过miRNAs的转录后调控[2]。

对小鼠坐骨神经损伤后远端miRNAs表达的研究发现，miR-34a可以直接与调控雪旺细胞增殖和脱分化的调节因子产生联系，从而提供了神经损伤后miRNAs在调节雪旺细胞在不同状态下转换的一种机制;miR-34a同时是一种肿瘤抑制基因，异常表达时可导致细胞周期的阻滞。并且周围神经损伤后调节雪旺细胞增殖、分化和细胞周期的2个重要基因Notch1和Ccnd1，恰好是肿瘤细胞中miR-34a的作用靶点，通过小鼠实验，神经损伤后，随着miR-34a表达下降，Notch1和Ccnd1表达增加；反之，上调miR-34a的表达之后，Notch1和Ccnd1的表达下降，因此在雪旺细胞中，miR-34a至少调节2种雪旺细胞增殖分化调控基因。RT-qPCR检测表明,在成年小鼠周围神经中miR-34a高表达，而在神经挤压伤或离断之后，miR-34a的表达迅速下降，雪旺细胞进入细胞循环周期呈现出分化状态。当miR-34a表达恢复到正常水平时，雪旺细胞退出细胞循环进而呈现出再分化状态[2]。

在周围神经损伤后，miR-140的表达也迅速下降，并且一直维持在较低水平，进而调控转录因子早期生长反应蛋白2(early growth response protein 2, Egr2)，伴随着雪旺细胞呈现出再分化状态，miR-140恢复到伤前水平，这说明miR-140的下调对雪旺细胞的再分化具有正向调控作用[2]。

3 miRNAs和自噬在周围神经再生修复的调控过程中可能存在相关性

miRNAs是一类在转录后水平调控目的基因的功能性小RNA 分子[2]。研究发现，miRNAs可以通过RNA干扰(RNA interference, RNAi)途径调控某些自噬相关基因及其调节因子[19]。

研究人员通过萤光素酶为基础的筛选方法，证实了miR-101可以明显抑制乳腺癌细胞中的自噬流，从而增加对他莫西芬的敏感性[8]；在肝癌细胞中miR-375的浓度很低，当肝癌细胞在缺血缺氧环境中诱发自噬时，稳定转染miR-375可以通过抑制PDK的表达，调控PDK/AKT/mTOR通路抑制自噬流，从而抑制肿瘤生长[30]。miR-204在抑癌基因VHL(von Hippel-Lindau)丢失的肾癌细胞内水平极低，在饥饿状态下，通过增加细胞内miR-204含量能影响细胞产生完整的自噬体，导致肿瘤增殖受限[31]。在肿瘤细胞中，beclin-1被认为是miR-30a的潜在作用靶点，抑制miR-30a表达时，beclin-1表达产物增多，当利用雷帕霉素诱导细胞自噬后，高表达miR-30a可以通过抑制beclin-1的表达抑制自噬的活跃度[32]。已有的研究表明，在乳腺癌组织中，miR-34通过BCL-2 /beclin-1/PI3K途径调节细胞自噬。在细胞因子作用下，PI3K活化，生成3位磷酸化的磷脂产物磷酸化PKB，活化的PKB从细胞膜脱离，进入胞质和胞核，使其下游分子发生磷酸化，从而促进细胞自噬[32]。

周围神经损伤后，为了修复神经的功能，雪旺细胞会经历一个包含脱分化、增殖以及再分化的反应过程。许多研究已证实，雪旺细胞的自噬过程参与周围神经损伤后再生修复的调控，雪旺细胞作为轴突再生的纽带，对其自噬的调控可以调节雪旺细胞的塑形性以及分化状态，进而影响轴突再生。而miRNAs通过转录后调控机制调控雪旺细胞的脱分化以及再分化。当今miRNAs对自噬调节的研究主要集中于肿瘤学，在神经损伤修复领域自噬与miRNAs的关系尚处于探索阶段。已有的研究发现自噬与miRNAs均与轴突再生、雪旺细胞塑形、增殖、分化、凋亡等有关，进一步我们推测miRNAs可能通某些转录后机制调控周围神经损伤后修复过程中的雪旺细胞的自噬作用。

4 展望

目前的研究表明，自噬与miRNAs均通过调控雪旺细胞的增殖、分化能力以及神经营养因子的分泌影响损伤后神经的再生修复，通过本文可以初步了解到自噬、miRNAs与周围神经损伤后再生修复过程中雪旺细胞的关系，但目前三者之间是否相互沟通联系并不清楚，且在神经学领域暂无相关报道，因此，探究周围神经损伤后雪旺细胞自噬与miRNAs的关系成为了一个亟需解决的问题，并为我们研究周围神经再生修复的分子机制提供了一个崭新的方向。