紫外-可见(UV-Vis)光谱法在中药质量控制中的应用

1. 天津中医药大学中药制药工程学院，天津 300193；2. 浙江大学药物信息学研究所，浙江 杭州 310058

紫外可见光谱(Ultraviolet-visible spectroscopy, UV-Vis)是指波长范围在200～760 nm之间的波段，该波段属于电子光谱，是由于价电子的跃迁而产生的吸收光谱。利用物质的分子或离子对紫外和可见光的吸收所产生的UV-Vis光谱及吸收程度可以对物质的组成、含量及结构进行分析、测定和推断。UV-Vis光谱用于具有紫外、可见光吸收物质的检测，灵敏度高，特征性好，在中药质量控制得到了广泛的应用。本文对UV-Vis光谱法在中药质量控制中的应用进行综述，并对其应用前景进行展望，以期为相关领域的研究提供参考。

1 比色法测定多种大类物质的含量

比色法(colorimetry)是通过比较或测量有色物质溶液颜色深度，并根据朗伯比尔定律确定待测组分浓度或含量的方法。常用的检测波段是UV-Vis波段，虽然该方法是一种历史悠久的传统分析方法，但目前在中药质量控制领域仍被广泛应用。

苏玉顺等[1]对UV-Vis光谱法测定植物多糖含量过程中的显色剂选取、测定条件的优化以及具体应用进行了分析，具有较好的参考价值。古炳明等[2]采用UV-Vis分光光度法建立了巴豆中可溶性蛋白含量的测定方法，检测波长为593 nm，巴豆中可溶性蛋白在0.010 3～0.103 0 mg/ml范围内线性关系良好,平均回收率为98.37%，RSD为1.01%，该方法简单、方便、专属性强，可为其质量评价提供理论依据。石婷婷等[3]采用UV-Vis方法考察了不同厂家脑得生片物质组释放特征，以UV-Vis法测定并计算各供试品溶液的物质组浓度及释放度，并采用Weilbull分布进行曲线拟合，考察了不同释放度测定装置、不同释放介质和不同搅拌桨转速对脑得生片物质组释放度的影响，并测定了不同厂家脑得生片物质组释放度。杨连菊等[4]采用UV-Vis测定了马应龙痔疮膏中氧化锌的含量，研究采用锌试剂显色的方法，以标准曲线法计算含量，结果表明，该方法与络合滴定法相比，准确、灵敏度高，适用于测定炉甘石药材及饮片中氧化锌的含量。

采用比色法进行大类物质测定时，有些可以直接利用待测物质特征结构对于UV-Vis波段的吸收进行测定，有些则需要先采用显色剂与待测物质结合、反应，从而产生UV-Vis波段的吸收，然后再进行测定。采用前一种方式，往往待测中药体系中其他杂质会对测定造成较大干扰，影响方法的选择性；而采用显色法，往往又因为操作过程复杂，显色条件难以准确控制等原因，导致方法的稳定性较差。另外，采用比色法测定大类物质含量，往往是选择一种标准物质制作标准曲线，所测含量为这种标准物质的折合含量，因此，采用不同标准物质测得的大类成分含量不具有可比性。

2 作为高效液相色谱(HPLC)分析方法的检测器

目前，高效液相色谱(HPLC)法最为常用的检测器是UV或DAD检测器，它是利用特定化合物在UV波段的特征吸收值与一定浓度之间的线性关系，对特定物质进行含量测定的。一般而言，对于含有共轭双键或苯环结构的化合物，其特征吸收明显，可选择其特征吸收波长作为检测波长，对于末端吸收或无明显特征吸收的化合物，可利用末端的非特征吸收波长，或者通过对目标成分进行衍生化处理，使其具有特征吸收，从而进行检测。非特征吸收检测波长，一般灵敏度、选择性稍差，衍生化处理则复杂耗时、经常使用有毒性的衍生化试剂，对于这类成分而言，UV并非上选，推荐使用其他类型的检测器，比如蒸发光散射检测器、示差折光检测器和质谱检测器等。

周惠芬等[5]以芦丁为对照品，检测波长272 nm，建立了UV-Vis整体考察补阳还五汤总黄酮含量方法，并采用HPLC方法同时检测了补阳还五汤总黄酮中毛蕊异黄酮、芒柄花素、羟基红花黄色素A的含量。结果表明，所建方法简单便捷，重现性好，有利于补阳还五汤中总黄酮的质量控制。该课题组还采用类似的方法对养阴通脑颗粒有效部位的质量控制[6]。值得注意的是，用于测定总黄酮的含量，需要进行较为复杂的前处理，而采用HPLC测定多种黄酮类物质，前处理则相对简单，而且黄酮类物质具有较好的紫外吸收特性，便于进行直接测定。黄翔等[7]建立同时测定丹红注射液中丹参素、原儿茶醛、咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B和丹酚酸A含量的高效液相色谱-二极管阵列检测器(HPLC-DAD)方法，结果表明，样品中6种成分分离良好，线性关系良好，该方法操作简单，结果准确，具有较好的重复性和稳定性，可为丹红注射液的质量控制提供参考。

对于氨基酸、糖、胆酸等UV-Vis波段无特征吸收的化合物，常采用柱前衍生化的方法进行预处理。陈萍红等[8]采用RP-HPLC法同时测定阿胶中13种氨基酸的量。该方法将阿胶以6 mol/L盐酸于120℃水解3 h，以异硫氰酸苯酯柱前衍生，用反相高效液相色谱法测定氨基酸的量。检测波长为254 nm。结果在36 min内可完成对阿胶中13种氨基酸的分离测定，各氨基酸的峰面积与浓度的线性关系良好，加样回收率为95.2%～104.4%，RSD<5.0%。方法准确，重复性好，可用于阿胶的质量控制，亦可为其他药物中氨基酸的分析提供参考。杨欢等[9]建立了柱前衍生HPLC-UV同时测定人工牛黄中胆酸及猪去氧胆酸的含量。方法以2-萘基溴甲基酮为衍生试剂，三乙胺为催化剂，60℃水浴条件下对胆酸及猪去氧胆酸进行衍生，考察衍生试剂用量、催化剂用量及反应时间等对衍生产物的影响，确定衍生反应的条件，然后考察建立HPLC-UV分离检测方法对人工牛黄中胆酸及猪去氧胆酸含量进行测定。结果表明，当衍生试剂的摩尔量与胆酸及猪去氧胆酸的摩尔总量的比大于30∶1，催化剂的摩尔量与两者的摩尔总量的比在5∶1～60∶1范围内，在60℃水浴条件下反应50 min时，胆酸及猪去氧胆酸的衍生物反应完全。胆酸在0.4～5.0 μg范围内线性关系良好(r=0.999 5)；猪去氧胆酸在0.12～1.5 μg范围内线性关系良好(r=0.999 8)。胆酸的平均回收率(n=6)为100%，RSD为2.40%；猪去氧胆酸的平均回收率(n=6)为101%，RSD为1.33%。该方法灵敏度高、准确可靠、稳定性和重复性好，可用于测定人工牛黄中胆酸及猪去氧胆酸的含量。类似的工作还有很多[10-11]。当然，也可采用末端吸收进行直接测定，彭波等[12]建立了RP-HPLC法测定熊去氧胆酸片中熊去氧胆酸含量的方法，该方法直接使用205nm为检测波长，结果表明熊去氧胆酸片中熊去氧胆酸及有关物质在测定范围内线性关系良好。测试方法精密度、稳定性、重现性尚可，平均回收率为98.5%～100.4%，将该方法应用于熊去氧胆酸中熊去氧胆酸及相关物质含量的测定具有简便、灵敏度高、准确性强的优势，能有效控制熊去氧胆酸片的质量。

3 紫外可见光谱与化学计量学技术的结合使用

将紫外光谱与化学计量学相结合，对全波段的紫外吸收光谱进行多变量数据分析，此方法已被广泛应用于制药行业的化学反应监测、食品品质鉴别及含量测定等领域[13-16]，可借鉴用于中药质量控制。常用的化学计量学方法方法包括多元线性回归(MLR)、主成分回归(PCR)、PLSR、多元曲线分辨(MCR)，以及聚类、判别分析方法等等。

吴柄桦等[17]研究紫外-可见-短波近红外漫反射光纤光谱技术结合化学计量学应用于鉴别白芷、葛根、当归、白术、白芍五种外观相似的中药材的可行性，对制样方法、光谱获取、特征信息提取、光谱预处理、数学模型的建立进行优化，旨在建立一种简便、快速鉴别中药材的方法，为中药材质量控制提供有价值的参考。朱向荣等[18]采用支持向量机对清开灵注射液六混中间体的UV光谱进行分析，实现了对4个批次的中药清开灵注射液六混中间体以及其混和批次共147个样本的鉴别。区晓云等[19]将UV光谱用于监测陈皮中橙皮苷的提取工艺研究，可对煎煮过程中橙皮苷的溶出浓度进行动态监测。孟庆华等[20]研究了UV光谱相似度在中药注射液质量控制中的应用，采用UV吸收光谱上所有数据点计算样品紫外光谱与多个对照品的光谱相似度，可以灵敏地反映谱图间的差异，通过与阈值的比较对样品质量进行评价，UV光谱相似度法可作为中药注射液质量控制的一种定性分析方法。邢丽红等[21]建立应用紫外光谱快速测定金银花提取物中5种有机酸含量的方法，该方法以HPLC法为参照，测定金银花提取物中绿原酸、咖啡酸、3,4-二咖啡酰奎宁酸、3,5-二咖啡酰奎宁酸、4,5-二咖啡酰奎宁酸等5种有机酸类成分的含量。在220-400 nm范围内扫描金银花提取物溶液的紫外吸收光谱,采用偏最小二乘回归(PLSR)法分别建立样品紫外吸收光谱与5种有机酸含量之间的校正模型，并对模型的预测能力进行考察。结果表明，5个校正模型对预测集样本的预测值与对照值的相关系数都在0.90以上，相对预测误差较小，预测结果准确，该方法操作简便、快速准确，可作为金银花提取物中有机酸含量测定的一种快速分析方法。郑辛甜等[22]建立了一种在线UV光谱采集系统，用于实时记录反应过程光谱，并采用MCR-ALS方法辨析化学变化信息，获取反应体系中目标组分的定性和定量信息。将上述方法应用于丹酚酸B、丹酚酸A 和黄芩苷的降解和转化过程，初步定量阐释了上述3种中药化学成份的降解规律。

4 结论

虽然目前各种光谱技术及其他色谱检测技术不断涌现，但UV-Vis波段作为一种选择性强、可解释程度高、与目标成分线性关系明确的检测技术，仍有广泛的应用前景。但可以预言，UV-Vis光谱检测将由单波长检测向多波长检测，固定波长检测向全光谱检测方向发展，而紫外-可见波段所蕴含的丰富的信息，也必将在化学计量学方法的辅助下，得到更为充分的应用。同时，作者认为，衍生化方法也必将因其操作繁琐、使用毒性试剂、重复性较差等缺点，而被逐步淘汰，因此，对于目前仍需要借助衍生显色的分析方法，必须尽快寻求新的替代方法。