“苦参碱分离纯化”的实验教学设计

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1.昆明理工大学生命科学与技术学院，云南 昆明 650500；2.云南大学化学科学与工程学院，云南 昆明 650091

1 引言

《制药分离工程》是制药工程专业一门重要的专业基础课，在制药工程专业课程体系中占有非常重要的地位。主要介绍药物的提取、分离与纯化理论与技术。该课程着重培养学生的工程意识，通过学习，逐渐具备解决工程实际问题的能力[1]。在传统的教学中存在着以下问题：①《制药分离工程》开课前学生很少接触工程实际问题，工程意识不强，实践基础薄弱，学生听不懂。②《制药分离工程》涉及一些分离操作原理，多采用模型和挂图等辅助教具进行讲解，教学手段单一，效果不好。③《制药分离工程》是一门实践性很强的课程，传统的考试模式是以闭卷笔试为主，主要考查的是学生记忆基本原理和技术的能力，不能提高学生运用基本原理和技术解决实际问题的能力。在当前高等教育着力于培养有创新能力的高素质人才的大背景下，教学时间的有限性与知识增长的无限性之间的矛盾日益突出，为了能使学生掌握本课程的基本内容，运用课程中的基本原理和技术解决实际问题的能力，在教学安排上增加《制药分离工程》教学实践环节。从云南制药工程专业的本科教学来看，从云南丰富的药用植物资源中分离天然药效成分，并为之设计有效的分离路线，进而付诸实践教学，不仅可以调动学生学习积极性，让学生从理论到实践得以跨越，真正做到“知行合一”，同时也为后续的制药工程生产实习和毕业实习奠定实践基础。

2 实验设计对象的选择

在《制药分离工程》教学实验设计时，以云南特色药用植物资源为出发点，选择有特色、有药效、有资源和有开发价值的药用植物开展《制药分离工程》教学实践。白刺花为豆科槐属植物白刺花(Sophora viciifolia)的花蕾，别名苦刺花，广泛分布于云南海拔2000～3500米的山坡上，白刺花在云南民间可食用[2]，具有抗炎、抗过敏、抗肿瘤等药理作用[3]，其中含有生物碱类化学物质，苦参碱是其中的药效成分[4]，苦参碱具有治疗抑制大肠癌细胞增殖、促大肠癌细胞凋亡、抗肝炎等功效[5]，目前已有苦参碱注射液上市销售[6]。云南具有广泛的白刺花植物资源，其中的苦参碱具有显著药效，选择白刺花，并设计其中苦参碱的分离纯化实验教学，对于《制药分离工程》教学具有较强的教学实践意义。

3 实验方案的设计

通过文献调研和实验条件的摸索，比对了几条实验路线，结合《制药分离工程》教材内容和云南植物药业有限公司的实际生产工艺，最终确定以下实验方案。

3.1 白刺花中总生物碱的提取 白刺花花蕾2.0 kg，阴干粉碎后用5 L 的丙酮室温提取3次，每次48 h，提取液合并，减压过滤，用旋转蒸发仪浓缩，最后得到197.2 g浸膏，用水将所得浸膏分散，正丁醇萃取后得到，正丁醇部分提取物160.0 g和水部分37.2 g。水部分用氨水调pH为10，氯仿萃取3次，得萃取物4.2 g。

3.2 白刺花中苦参碱的分离 将氯仿萃取物进行硅胶柱层析，流动相条件为：石油醚/丙酮/二乙胺(体积比为30∶1∶0.2)，梯度洗脱，逐渐增加丙酮的体积，直到流动相的体积比为10∶10∶0.2，同时采用薄层层析法将相同洗脱成分合并，最终得到了4个部分(Fr.W1-Fr.W4)。对Fr.W3进行硅胶柱层析，流动相为氯仿/甲醇(98∶2)，得到化合物1(836 mg)和化合物2(50 mg)。以苦参碱为标准品，采用薄层层析法将化合物1、2与苦参碱标准品在薄层板上展开，展开剂为氯仿/甲醇/氨水(比例为90∶7∶3)，显色剂为用碘化铋钾试剂喷雾，最终苦参碱样点显橙红色，经过比移值Rf比对，确定化合物1为苦参碱。

3.3 白刺花中苦参碱的纯化 将分离得到的苦参碱置于5～8 mL的热水(70～80 ℃)中溶解，加入15%的NaOH，边滴加边搅拌，直至苦参碱溶解完全，冷却，静置24 h，过滤，所得结晶体用8～10 mL石油醚于40～50 ℃下回流溶解，热滤，母液冷却后静置24 h，过滤后用石油醚清洗晶体，40～50 ℃真空干燥，得到柱状苦参碱晶体。

3.4 结构表征所得化合物 通过与对照品进行薄层层析的比对分析初步确定苦参碱，再通过核磁共振进行测定，测定所得数据如下：1H NMR (CDCl3, 500 MHZ) δppm:4.35 (1H, m, He-17), 3.74(1H, m, H-11), 3.00 (1H, m, Ha-17), 2.78 (1H, d, J=11.5 Hz, He-10), 2.70(1H, d, J =11.5 Hz, He-2), 2.31(1H, m, He-14), 2.14(1H, m, Ha-14), 1.96(2H, m, Ha-10,); 13C NMR (CDCl3, 125 MHz) δppm: 57.5(C-2), 21.0(C-3), 27.6(C-4), 35.3(C-5), 64.0(C-6), 41.9(C-7), 26.8(C-8), 21.9(C-9), 58.0(C-10), 53.5(C-11), 27.5(C-12), 19.1(C-13), 33.0(C-14), 170.1(C-15), 43.1(C-17)。

4 实验教学中的注意事项

4.1 白刺花采收和苦参碱成分的预判 采收白刺花后，引导学生用少量样品进行预实验，通过与苦参碱对照品进行薄层层析比对分析，预先判断是否含有苦参碱，并学习从薄层斑点的大小初步判断苦参碱的含量。

4.2 提取工艺 得到苦参碱结晶体后，让学生计算得率，从提高得率和环保角度出发，引导学生在提取溶剂种类、溶剂料液比、时间、温度、原料预处理等方面进行思考，深入设计实验，并反复比对实验结果，总结得到最佳提取方法。结晶时以结晶量的多少和结晶含量高低为主要考虑因素，引导学生从结晶溶液浓度、NaOH用量、结晶温度和加入晶种方法考虑结晶工艺的优化，深入开展后续实验，优选最佳工艺。

5 小结

本实验教学内容涵盖了《制药分离工程》中固液提取、液液萃取、色谱分离和结晶等课程内容，通过以上实验，使学生加深了以上教学内容的思考和理解，学生掌握了固液萃取、液液萃取、色谱分离和结晶的基本操作方法，深入掌握了以上分离技术的原理。同时，在实验过程中还碰到了一些具体问题，如：提取率低、苦参碱纯度不高、杂质多等，通过对以上问题的分析和解决，使学生真正学会了从经济、有效和环保的角度出发，深入思考和解决药物分离问题。综上所述，苦参碱的分离纯化实验教学，能有效提高学生学习《制药分离工程》的积极性，加深学生对本课程的思考和认识，有效提高教学质量。

[1]李洁琼, 齐滨, 于波,等. 制药分离工程教学改革探索与实践[J]. 教育教学论坛, 2017(11):83-84.

[2]吴荣书, 袁唯, 赵燕. 野生白刺花的加工技术研究[J]. 食品科学, 2000, 21(8):67-68.

[3]毛晓健, 温敏, 蒋孝悝. 白刺花水煎剂的部分药效学研究[J]. 云南中医中药杂志, 2009, 30(2):44-46.

[4]董刘宏, 太志刚, 杨亚滨,等. 白刺花花的化学成分研究[J]. 华西药学杂志, 2010, 25(6):636-640.

[5]王菁雯, 沈克平. 中医药对大肠癌信号通路的调控作用[J]. 中国实验方剂学杂志, 2018(1):227-234.

[6]白建刚, 朱伟平, 罗金武,等. 苦参碱注射液治疗乙型肝炎疗效观察[J].中国医药导报, 2007, 4(17):19-20.