寻常型天疱疮自身抗体检测及治疗方法的进展

潘萌 郑捷

200025上海交通大学医学院附属瑞金医院皮肤科

寻常型天疱疮（pemphigus vulgaris，PV）是一累及皮肤与黏膜的自身免疫性皮肤病，属于表皮内大疱病，临床上较常见，可表现为广泛的红斑、松弛的水疱及糜烂、结痂面，尼氏征阳性。患者血清中存在针对桥粒黏蛋白1（desmoglein1，Dsg1，相对分子质量160 000）和（或）抗桥粒黏蛋白3（desmoglein3，Dsg3，相对分子质量130 000）的IgG型抗体［1］，该抗体和自身抗原结合，导致细胞间连接破坏，棘层松解发生和表皮内水疱形成［2］。根据PV患者血清中存在的自身抗体类型，可以分为黏膜主导型（mucosal dominant）与皮肤黏膜型（mucocutaneous）。自身抗体的种类和Dsg1/Dsg3抗原在正常组织不同分布，决定了水疱在表皮内的位置。大多数患者自身抗体的滴度和疾病严重度呈相关性，但部分患者例外，在这部分患者中，IgG1和IgG4抗体亚型［3］则非常重要。近年来，PV的发病机制不断完善，除了循环自身抗体的致病作用外，我们团队首次发现患者皮损局部存在抗原特异性B淋巴细胞，可产生特异性抗Dsg的抗体，加重局部免疫反应，参与皮损的发生和发展。另外，在皮损局部还可检测到浆细胞、反应性T细胞、高内皮小静脉（high endothelial venule，HEV）等，从而进一步推测在PV皮损局部存在有异位淋巴结构（ectopic lymphoid-like structure，ELS）［4］，为局部B细胞的成熟、活化、产生抗体提供一个必要的场所。

一、PV自身抗体的检测手段

PV的诊断通常基于患者的临床表现、组织病理学及免疫病理学检查，其中针对特异性自身抗体的检测尤其重要，包括直接免疫荧光法（DIF）、间接免疫荧光法（IIF）、酶联免疫吸附法（ELISA）和免疫印迹技术（immunoblotting test，IBT）［5］等。

1.DIF和IIF：自身抗体的DIF检测对于PV血清学诊断起到举足轻重的作用，通过该方法将患者血清与正常皮肤制作成的冰冻切片进行孵育，然后再将抗人IgG的荧光抗体与已结合了血清中自身抗体的组织孵育，采用显微镜观察，可以发现患者的IgG抗体在角质形成细胞间沉积。目前大多DIF检测需要人工操作及结果判断，考虑到人为因素可能导致检测结果的不确定性，有学者采用EUROTide™孵育技术结合基于生物芯片的EUROPath系统提出了一种新型的自动化DIF技术［6］，该系统使得液体可以沿固相结合组织切片连续运动通过抑制浓度梯度的形成，提高反应速度，得到快速而均匀的染色结果，简化了染色程序并改善了组化结果的表现，使其具备更高的敏感性和特异性，从而提高诊断的准确性。

IIF也是一种对PV循环自身抗体进行检测的常用工具，底物通常选择对检测最敏感的豚鼠或猴食道［5］。随着免疫学和分子生物学的发展，更加便捷和高效的荧光检测还在不断涌现。2014年，Russo等［7］提出了一种新型的基于重组抗原底物和转染细胞的免疫荧光检测-生物芯片马赛克技术（biochip immunofluorescence microscopy），可以一步法检测抗Dsg1、抗Dsg3抗体及抗BP180、抗BP230抗体（大疱性类天疱疮的自身抗体），该方法简便易行，操作时间短，敏感度和特异度高，是一种可以替代经典IIF检测的标准化检测手段；该技术一般采用表达重组人Dsg1、Dsg3的人类细胞（HEK293细胞）作为底物来进行患者血清中特异性抗体的体外检测，如果需要，生物芯片马赛克技术也可采用定制底物，特别是人盐裂皮肤和猴食道或重组斑点；该技术的另一个优点是可以进行底物的大批量自动生成，从而保证了检测的稳定性和可重复性。

在进行IIF检测时，一定要注意避免ABO血型系统的干扰。我们曾报道临床和组织病理表现为表皮下水疱的患者IIF显示棘细胞间IgG沉积，该患者临床上表现为瘙痒性红斑基础上产生紧张性水疱和大疱，病理表现为表皮下水疱形成，盐裂DIF表现为真皮侧IgG及C3沿基底膜带的线状沉积，拟诊获得性大疱表皮松解症；但该患者却在IIF上表现为天疱疮模式，即出现了IIF的假阳性［8］；后查阅文献发现IIF的底物，如猴食道上皮可以表达人类ABO抗原［9］，而该患者为A型血，其血清中抗B抗体结合猴食道上皮细胞表面的B抗原，从而发生抗原-抗体反应，产生IIF的假阳性，而在我们去除了AB型红细胞之后，再进行IIF检测，其结果则为阴性，所以此IIF假阳性系ABO血型抗体干扰所致。除此之外，烧伤、接触性皮炎、感染及药物反应等患者的血清中也会出现自身抗体，这些患者的IIF可出现类似于PV患者的IIF模式，这可能是由于病理状态下抗原模拟或抗原扩展而导致［10］。所以，IIF虽然是PV患者自身抗体检测的常规方法，但它的敏感度较低，可能会出现检测结果的假阳性或假阴性，因此，提高自身抗体检测的准确性还需采用多种检测方法进行。

2.免疫印迹技术：采用表皮提取物及人类羊膜（amniotic membrane）［11］作为底物对PV患者血清中的自身抗体进行免疫印迹检测，因系无创检查，方法简便，敏感性高，且可以检测到较大范围的抗体谱，甚至发现新的抗原，曾用于PV的诊断［12］，但由于Dsg1与Dsg3的表位多为构象型表位，免疫印迹技术对于PV的诊断意义不大［13］，但该方法却是发现和探索新的大疱性皮肤病自身抗原成分的有效手段。我们近来对4例多次检测Dsg抗体结果均为阴性的表皮内水疱患者进行免疫印迹检测，切取蛋白条带进行LC-MSMS质谱鉴定，搜库检索结果提示患者自身抗体所结合的蛋白结构与桥斑蛋白高度匹配，从而证明了该4例患者的自身抗原为桥斑蛋白，患者体内产生了针对桥斑蛋白的抗体。

3.酶联免疫吸附法：日本MBL公司及德国欧蒙公司分别采用昆虫细胞和人类HEK293细胞表达重组人Dsg1与Dsg3的胞外段，建立了酶联免疫吸附法，对PV患者血清中的特异性自身抗体进行定量检测，该方法因具备敏感度及特异度高的特点，目前已越来越广泛地用于PV的临床诊断，并进一步对天疱疮的临床亚型进行分类；除此之外，多项研究表明，ELISA的反应性与天疱疮患者的疾病严重程度相关［14-16］，因此还可以用于疗效评估和预后判断，指导临床治疗。近几年，日本MBL公司推出了一个新型抗体检测试剂盒——MESACUP anti-Skin profile TEST”（ASPT），该试剂盒的微孔中分别包被了5种不同的重组抗原，可以快速同时对患者血清中抗Dsg1，抗Dsg3，抗BP180，抗BP230及抗Ⅷ型胶原的IgG抗体进行定量检测，具有特异性高的特点，对诊断困难的大疱性皮肤病具有重要的诊断意义，还可以发现一些互相伴发的大疱性疾病；化学发光酶免疫分析法（chemiluminescent enzyme immunoassay，CLEIA）［17］是一种基于酶-抗体结合，采用化学发光底物和照度计进行检测的免疫分析新方法，该方法将磁珠结合抗原颗粒作为底物，用于检测抗原特异性Dsg抗体；CLEIA与ELISA法相比具有更多的优势，除了检测更加敏感之外，该方法采用了完全自动化的系统，较ELISA法更为快速，而且其具备更广的线性检测区间，因此不需要对血清样本进行高倍稀释，很大程度上节约了样本。

总之，PV自身抗体的检测手段日趋完善，具有更高效、便捷、快速的特点，将会在临床上进一步推广。

二、PV治疗手段

PV治疗比较棘手，可能原因有几个方面：①疾病的一线治疗药物糖皮质激素（激素）和免疫抑制剂在使用过程中可能产生严重的并发症或不良反应；②即使疾病严重度评分完全相同的两个患者，其对标准治疗的反应可能不同；③PV容易复发，而复发的患者对再次治疗的敏感性降低；④天疱疮抗体滴度的检测没有完全普及，缺乏科学的指导用药；⑤CD20单抗——利妥昔单抗（rituximab）治疗天疱疮有效，但由于其价格昂贵和潜在的不良反应，尚未普及应用。因此，上述原因加大了治疗难度。

目前，我们在PV的治疗方面总结了十六字原则：“早期诊断、及时治疗、精心护理、长期随访”。总策略是：推荐系统联合应用激素和免疫抑制剂；同时局部外用激素，并根据需要外用抗菌药物；轻度PV或皮疹局限可单独外用激素或钙调神经磷酸酶抑制剂。在上述原则上，须遵从个体化治疗。PV治疗上一般可分为初始治疗和维持治疗［18］。

1.初始治疗：初始治疗目标是控制疾病活动。控制疾病活动（control of disease activity）定义为：无新发水疱、糜烂面，现有皮损开始愈合［19］。

（1）激素：推荐系统用激素起始剂量0.5～1.0 mg·kg-1·d-1，根据疾病严重程度、患者年龄、及是否有基础疾病进行选择［20］。如果1～2周内，初次用药剂量无法控制病情，推荐药量增加50%。有一项22例的小型随机试验对低剂量和高剂量激素进行了直接比较，该试验对新诊断为PV19例或落叶型天疱疮（pemphigus foliaceus，PF）3例患者采用高剂量泼尼松（120～150 mg/d）与较低剂量泼尼松（45～60 mg/d）治疗进行了对照。高剂量组与较低剂量组实现初始疾病控制所需时间之间差异无统计学意义；两组实现初始疾病控制的平均时间分别为20 d（5～42 d）与24 d（7～42 d）。不良反应发生率之间的差异也无统计学意义［21］。

（2）非甾体免疫抑制剂：推荐联合使用激素和非甾体免疫抑制剂。临床研究已证实，同时使用免疫抑制剂硫唑嘌呤（AZA）、吗替麦考酚酯（MMF）、甲氨蝶呤（MTX）、环磷酰胺（CTX）能够减少激素用量，缩短激素开始减量时间且可以在激素减量过程中防止疾病复发［20，22］。最近一项回顾性研究显示：如果不用免疫抑制剂，单用激素（≤0.5 mg/kg或≥1.0 mg/kg）不能获得完全的临床缓解。这项研究的中位随访时间为（77±64）个月［23］。我们对2007年9月至2014年7月上海交通大学医学院附属瑞金医院皮肤科就诊的天疱疮患者共计234例进行回顾性分析。对系统应用激素组和激素联合非甾体免疫抑制剂组的复发率进行比较，发现系统应用激素组复发率高于激素联合非甾体免疫抑制剂组，差异有统计学意义（P=0.016），复发率分别为27.4%以及14.2%。对激素联合不同非甾体免疫抑制剂的复发率进行比较，3组不同细胞毒药物组AZA、MTX和CTX的复发率差异无统计学意义（P=0.445），复发率分别为12.5%、15.2%、22.2%。

值得一提的是，硫唑嘌呤的代谢受到硫代嘌呤甲基转移酶（thiopurine methyltransferase，TPMT）活性水平的影响。TPMT活性降低与硫唑嘌呤诱发的骨髓抑制风险增加相关。在进行硫唑嘌呤治疗前，检测TPMT基因型和（或）TPMT酶活性可能有助于预防骨髓抑制发生。在开始硫唑嘌呤治疗后，所有患者均应每隔1周进行1次血常规及肝功能检查，持续8周，此后每3个月至少检查1次［24-27］。

（3）生物制剂：推荐皮损累及体表面积超过30%和（或）黏膜损害严重的患者，或对治疗抵抗（指：给予12周首次足量治疗后疾病活动仍未控制）患者［18］，或有激素治疗禁忌，或对激素有严重药物不良反应，应用直接或间接针对自身抗体的治疗手段，包括利妥昔单抗、静脉用丙种球蛋白人（IVIG）。利妥昔单抗（第1天、第14天1 000 mg或者375 mg/m2静脉滴注每周1次共4次）或静脉用丙种球蛋白（2 g/kg每个治疗周期，每4～6周1次）。2017年Lancet发表了Joly等［28］利用利妥昔单抗联合短期泼尼松疗法治疗天疱疮（82%为PV，18%为落叶型天疱疮）的研究。试验结果表明，相比于单独泼尼松治疗，利妥昔单抗联合短期泼尼松疗法在疗效及安全性上更具优势。研究对象为初发未治疗患者。试验组接受利妥昔单抗及系统用小剂量激素，利妥昔单抗第1、14天分别系统用1 000 mg，第12、18个月分别系统用500 mg。同时联合激素0.5～1 mg·kg-1·d-1，在3～6个月内减量。对照组系统用激素1～1.5 mg·kg-1·d-1，在12～18个月内减量。在第24个月，实验组89%（41/46）患者停药并获得完全缓解，对照组15%（34/44）的患者停药并获得完全缓解。

（4）局部外用药及支持治疗：包括根据病情进行创面管理，使用避免2次损伤的创面敷料，使用止痛漱口水（如果有口腔黏膜累及），给予足够的镇痛剂，以及可能的营养素补充（如果有口腔及下咽部痛性糜烂）及定期的口腔检查［18］。我们对27例天疱疮患者进行局部外用强效激素治疗，其临床总有效率达70.4%（19/27）。尤其是复发的患者或者局部顽固性皮损不愈合的患者，可首先考虑加用强效激素疗法，从而避免长期大剂量系统使用激素带来的不良反应。

2.维持治疗：如果已经有1～2周无新发皮损，并且有80%的皮损已经愈合，可以进入维持治疗。一旦疾病活动得到控制，则系统用激素开始减量。速度控制在每1～2周减量25%。低于每天20 mg，每2～4周减量25%。对于长期治疗，低于每天7.5 mg后，根据疾病的活动，缓慢减量。Wang等［29］推荐了非常清晰激素减量规则，即每年减量50%，第5年减到10 mg/d，长期维持10 mg/d可以避免复发。

复发定义为：1个月内有多于3个皮损（水疱或糜烂），不能在1周内自行好转；或在疾病活动控制的患者，原有皮损有进展。推荐以下治疗策略：如果疾病复发，恢复到减量前的上一个剂量。如果疾病控制时间＜2周，重新开始药物减量过程。如果恢复剂量后，疾病的活动没有控制，恢复到首次系统用药的剂量。如果需要，可以改变免疫抑制剂的种类［18］。对于复发患者，我们的经验是，首先考虑更换激素种类（如醋酸泼尼松更换为甲泼尼龙）或剂型（如口服激素更换为静脉用）。另外，可考虑更换免疫抑制剂的种类以及加强外用强效激素。对于较为严重的患者可考虑使用静脉用丙种球蛋白、美罗华及血浆置换。

三、结语和展望

PV是一类危重的皮肤病，由于其具有明确的自身抗原和自身抗体，已成为研究器官特异性自身免疫病的模型。随着研究的进一步深入，新的诊断方法和治疗手段应运而生，将逐步应用于临床，提高诊断的正确性、积极指导临床用药；从而判断预后、提高疗效、减少并发症、降低死亡率。目前已在全国范围内成立了大疱病患者的数据录入平台，拟通过多中心的协作，收集更多患者的诊疗数据。希望在不远的将来在这个大数据诊疗平台的支持下，探索出符合我国国情的诊断标准和治疗规范。

近年来，随着研究进展，发现激素和利妥昔单抗，在抑制免疫系统的同时，增加了患者潜在致命性的机会性感染和肿瘤风险。靶向治疗抗原特异性B细胞一直是自身免疫性疾病的最高治疗目标。2017年，Payne等研究设计了人类T细胞表达的嵌合自身抗体受体（chimeric autoantibody y receptor，CAAR），由PV的自身抗原—Dsg3，融合cd137-cdζ信号域构成。在体外实验中，Dsg3 CAAR-T细胞对表达抗Dsg3 B细胞受体的细胞具有特异性杀伤性。在体内试验中，Dsg3 CAAR-T细胞能够扩增，存活并特异性地消除Dsg3特异性B细胞。研究者希望进行进一步的在体实验，如果研究成功，将成为治疗PV的最有效方式［30］，更好地造福于广大患者。

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