牛体外胚胎培养技术研究进展

许红喜，于治国，孙晓玉*

(1.黑龙江农垦科学院 畜牧兽医研究所，哈尔滨；2.大庆石油管理局农场，大庆)

前言 近年来，随着畜牧业和胚胎生物技术的迅速发展，对质优价廉的良种胚胎需求量越来越大，单凭超数排卵获得的胚胎已不能满足科研与生产的需要。牛体外受精技术越来越受到重视，该技术不仅能加快供体牛优良遗传性状繁育进程，且可以保存优良品种供体牛并使其得到扩繁。根据本人产业化培养雪龙黑牛体外胚胎的多年生产实践经验，对牛体外受精技术程序的各个环节，即卵母细胞的获得、卵母细胞体外成熟、精子获能、卵母细胞体外受精和受精卵体外培养等等关键步骤进行研究经验，以及国内外对牛体外受精技术的研究进展进行总结归纳。

1 卵丘细胞卵母细胞复合体(COCs)获得

1.1 屠宰采卵

屠宰采卵方法是将在屠宰场切下来的卵巢放入30～35℃灭菌的PBS(含有1UI.mL-1青霉素/链霉素)中,1小时内保温带到实验室，用35～36℃灭菌磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤，用无菌剪刀去除多余的脂肪组织和皮质等，用75%酒精洗涤1次，再用PBS液反复洗涤3次，抽取卵母细胞培养。1.3用5 mL一次性注射器、用18G的针头抽取直径2～6 mm卵泡，将抽吸的卵泡液注入14 mL灭菌收集管内，静置10 min，用5 mL移液器吸取下层沉淀，移入大培养皿中，静止2 min后，在体视显微镜下用捡卵针捡出卵母细胞卵丘细胞复合体(COCs)放到成熟培养液中洗涤3～5次[1]。

1.2 活体采卵

活体采卵有盲采法、内窥镜法和B型超导引法三种，目前B超导引法己经成为国际上最主要的活体采卵方法之一,荷兰的pieterse首先利用超声波技术B超通过阴道壁从活体牛卵巢采到卵母细胞。国外很多学者对该技术进行了广泛深入的研究。B型超声波导引法主要利用不同组织对高频声波吸收和反射强度不同的原理,当探头在阴道弯隆处与卵巢接触时,黄体、卵泡和卵巢结构在屏幕上显示明暗不同的图像，卵泡呈大小不同边缘清晰的黑色圆形图像，黄体的图像一般比卵泡的图像大，且边缘不太清晰卵巢实质呈灰白色穿刺针呈亮白色，操作者据此进行采卵操作[2]。

2 卵丘细胞卵母细胞复合体(COCs)体外成熟培养

判定牛卵母细胞体外成熟方法有3种，分别为卵丘细胞扩展分级法、形态学观察第一极体排放法和固定染色观察法[12]。荷兰2001年De Wit研究了成熟培养液中加入6 mM尿素，因为这个浓度是日粮高蛋白的奶牛血液中的生理浓度，培养牛卵母细胞和卵丘细胞复合体，在培养8h染色观察时发现卵母细胞核生发泡破裂染色体浓缩细胞减数分裂MI期的比例高于没加尿素的，但是染色体分离和第一极体排出受到抑制[3]。M.Rerat体外胚胎生产卵母细胞体外成熟培养液为0.95 g/100 mLM199(Sigma)，0.22g/100 mL NaHCO3(Sigma)，15% 胎牛血清，5 IU/mL hCG，PG600,青链霉素60IU/mL[5]。有研究认为牛卵母细胞体外成熟液中添加β-巯基乙醇，随着β-巯基乙醇浓度的提高，对卵母细胞成熟率有提高的趋势,对卵裂率和囊胚率无显著影响,但显著提高了胚胎发育速度[9]。朱淑文研究2%CO2浓度下培养卵母细胞囊胚发育率高于5%CO2浓度[10]。

3 卵丘细胞卵母细胞复合体(COCs)的体外受精

分离死精和卵黄等精液保护液方法有BO上浮法和Percoll法纯化，研究表明Percoll法处理精子更简便、快速、经济、精子回收率高和精液洁净。Percoll不连续密度梯度液是在10 mL离心管中先加入90% Percoll液2 mL，然后加入45% Percoll液2 mL配得，置于CO2箱中平衡1～2 h，冷冻精液在39℃水浴中解冻后,置于经平衡Percoll液上，400 g离心5～40 min后，弃掉上清液，底部精子团用5 mLSP-TALP液稀释[13]，Percoll法能显著提高卵母细胞的卵裂率，受精液多用TCM199、TALP以及获能物质肝素、咖啡因等，9 h的精卵体外孵育时间已经能够获得良好的卵裂率和囊胚率[9]。性控胚胎生产是应用优质种公牛的精液经流式细胞仪分离XY精子，再进行精子纯化和获能，精卵体外孵育，获得牛性控胚胎[4]。

4 受精卵的体外培养

研究在成熟液中加入表皮生长因子EGF对牛卵母细胞的体外成熟和受精后的早期胚胎的发育都有促进作用，在一定范围内增加EGF浓度不会提高受精率和囊胚率，受精液中加入一定浓度谷胱甘肽GSH 能够提高受精率和囊胚率，但是在高浓度的GSH时则影响受精率[8]。刘新峰研究了以受精液为 TALP液, 受精卵培养液为 60% TALP液 + 40%M-199液+ 5% FCS的过渡培养体系能够提高牛体外成熟卵母细胞的受精率和卵裂率[5]禹学礼等研究了牛卵泡液(BFF)浓度、颗粒细胞单层(GCM)和培养微滴大小对牛卵母细胞体外发育潜力的影响得出与未添加BFF的对照组相比,成熟培养液中分别加入10%,20%和40%的混合BFF,均可明显促进卵母细胞受精后的发育，但20%组和40%组出现卵母细胞或胚胎粘连。成熟培养液中以添加10%的混合BFF较为适宜。添加GCM对1级卵母细胞的卵裂率、6～8细胞发育率和囊胚率无显著影响，但添加GCM的2级、3级卵母细胞受精后的卵裂率、6～8细胞发育率和囊胚率分别显著高于未添加组。(3)将取自每头牛的约20枚卵母细胞，分别置于不同大小的微滴(30、50、100和200 μL)中培养，30和50 μL组的囊胚发育率显著高于100和200 μL组[10]。J. Xu研究100 μL微滴卵裂率和囊胚发育率都高于50 μL，他总结说50和100 μL组都放了25枚卵子，受精率和囊胚发育率不同取决于精子在微滴中的终浓度和精卵比例[6]。卵母细胞和精子的来源和质量是该技术程序的限制性因素，受低营养的供体母牛产生劣质卵子、先收集卵子有过早成熟的趋势和较高的不稳定性、年幼或年老的供体母牛产生劣质卵子，以及各批次、各管精液存在着受精能力的差异等许多因素都会影响体外胚胎的数量和质量。

参考文献:

[1] 许红喜，张智军,邢雪森,吴蒙,张继国,徐仙洲,王忠来,白苏友拉图. 雪龙黑牛活体采卵与屠宰采卵在体外受精技术中的应用研究[J]. 中国奶牛,2013,31(16):12-14.

[2] 麻柱. 荷斯坦奶牛活体采卵与体外受精技术研究[D].河北农业大学,2006.

[3] A. A. C. De Wit. Effect of Urea During In Vitro Maturation on Nuclear Maturation and Embryo Development of Bovine Cumulus-Oocyte-Complexes [J].Dairy Sci.2001,84:1800-1804.

[4] IR. D. Wilson.in Vitro Production of Holstein Embryos Using Sex-Sorted Sperm and Oocytes from Selected Cull Cows[J].Dairy Sci. 2005,88:776-782.

[5] M.Rerat.In Vitro Embryo Production:Growth Performance,Feed Efficiency,and Hematological,Metabolic,and Endocrine Status in Calves[J].Dairy Sci. 2005,88:2579-2593.

[6] J. Xu.Developmental Potential of Vitrified Holstein Cattle Embryos Fertilized In Vitro with Sex-Sorted Sperm[J].Dairy Sci. 2006,89:2510-2518.

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[8] 胥焘，窦忠英，陈静波.EGF和GSH对牛卵母细胞体外受精的影响[J].中国农学通报，2005,21( 6):55-57.

[9] 冯佳时. 精子处理方法及β-巯基乙醇对牛体外受精的影响[D].华中农业大学,2011.

[10] 禹学礼.培养条件对牛卵母细胞体外受精后胚胎发育的影响[J].西北农林科技大学学报，2005,33( 8):16-20.

[11] 朱淑文.不同浓度CO2牛卵母细胞体外成熟和受精的影响[J].动物科学与动物医学，2003,20( 9):43-44.

[12] 李晓霞，曹平华，禹学礼.牛体外发育卵母细胞成熟的评估方法研究[J].河南农业科学，2013,42(7): 130-133.

[13] 陈善军，梁冠生，张嘉保，王艳军，吴宏，刘健.Percoll法处理牛精子对体外受精胚胎发育的影响[J].中国兽医学报1998，18(4)：394-397.