不同质量卵裂胚来源囊胚冻融移植临床结局的比较分析

彭姝明，刘海鹏，李苏萍，杨帆，段丽

(郴州市第一人民医院生殖医学中心，郴州 423000)

辅助生殖技术(ART)至今已经经历了40余年的发展。时至今日，囊胚培养和移植技术已经广泛应用于临床，是提升ART成功率的有力手段之一[1-3]。目前，单囊胚移植尤其是选择性单囊胚移植已成为提高ART成功率并且降低多胎率的常规策略。在单囊胚移植的背景下，如何挑选具有最佳种植潜能的囊胚进行移植以获得最好的临床结局是广大ART工作者面临的难题。目前形态学评估仍然是挑选囊胚的主要手段。本研究回顾性分析了本中心近年来的单个冻融囊胚移植周期数据，通过对不同质量的受精后第3天(D3)卵裂胚来源的冻融囊胚移植的临床结局进行比较分析，试图为选择性单囊胚移植的囊胚挑选策略提供新的参考。

一、资料与方法

1.研究对象及分组：回顾性分析郴州市第一人民医院生殖医学中心在2018年1月至2020年9月期间进行的单囊胚冻融移植周期。纳入标准：单个冻融囊胚移植周期，所有囊胚均来源于IVF正常受精的可利用D3卵裂胚；患者基础FSH<12 U/L；患者体质量指数正常(18.5 kg/m2

共纳入653个单囊胚冻融移植周期。根据囊胚培养来源的D3卵裂胚质量分为优质卵裂胚组(n=445)和非优质卵裂胚组(n=208)。

2.子宫内膜准备方案：(1)激素替代周期：适用于月经不规则的患者。递增法口服戊酸雌二醇(补佳乐，拜耳制药，德国)，月经第2～4天开始口服4 mg/d，每4 d递增 2 mg；12 d后B超监测子宫内膜厚度，并检测血清雌二醇(E2)、孕酮(P)水平，酌情调整补佳乐剂量，继续促内膜生长或者添加孕激素行黄体转换。当子宫内膜厚度≥7 mm、血清E2≥735 pmol/L、P<3.14 pmol/L时，开始黄体转换：添加黄体酮针(浙江仙琚制药)60 mg肌肉注射，每日1次至胚胎移植日。开始黄体转换日定为Day0，于Day5或Day6行囊胚移植。(2)自然周期：适用于月经规律的患者。从月经第11天开始行阴道B超监测排卵，排卵日定为Day0，于Day0开始黄体酮针40 mg肌肉注射，每日1次至胚胎移植日，于Day5或Day6行囊胚移植。

3.冻融囊胚的解冻及培养：冻融囊胚移植当天上午进行囊胚的解冻。采用玻璃化复苏试剂盒(Vitrification VT102，KITAZATO，日本)，将载杆在液氮中取掉套管后拿出，迅速置室温下解冻液(TS)中1 min，然后分别将囊胚移入稀释液(DS)中3 min、洗涤液1(WS1)中5 min、洗涤液2(WS2)中5 min，再将囊胚转入囊胚培养液(G2，Vitrolife-G5系列序贯培养液，瑞典)中观察评分并行激光辅助孵化，置于三气培养箱内(37℃、6%CO2、5%O2)培养2 h后移植。

4.胚胎评价标准：(1)卵裂胚：正常受精后D3卵裂球≥4个、碎片<50%者为可利用卵裂胚；D3卵裂球为7～9个、碎片<20%者为优质卵裂胚；(2)囊胚：按Gardner囊胚评分系统评价，本中心规定D5或D6达3BC或3CB及以上级别者为可冷冻囊胚；D5或D6囊胚腔扩张程度4～6期、内细胞团或滋养层评分为A或者B级者为优质囊胚。

5.妊娠判断标准：囊胚移植后第11天测定血清HCG水平，血清HCG水平>5 U/L为HCG阳性；囊胚移植后4周，超声检查见孕囊或见胎心搏动则判定为临床妊娠。

6.观察指标：复苏优质囊胚率=优质囊胚数/复苏存活囊胚数×100%；临床妊娠率=临床妊娠周期数/移植周期数×100%；胚胎种植率=孕囊数/移植胚胎数×100%；流产率=流产周期数/临床妊娠周期数×100%；活产率=分娩胎儿的周期数/移植周期数×100%。

二、结果

1.囊胚培养及冷冻/复苏情况：本研究共纳入653个单囊胚冻融移植周期。根据囊胚培养来源的D3卵裂胚质量分为优质卵裂胚组(n=445)和非优质卵裂胚组(n=208)。优质卵裂胚组优质囊胚率显著高于非优质卵裂胚组(P<0.05)；两组间囊胚冷冻时期和囊胚复苏率比较均无显著性差异(P>0.05)(表1)。

表1 不同质量D3卵裂胚行囊胚培养及冷冻/复苏情况比较(%)

2.优质囊胚移植周期患者一般情况及临床结局：移植优质囊胚435个周期，其中来源于D3优质卵裂胚333个周期(优质卵裂胚组)，来自于非优质卵裂胚102个周期(非优质卵裂胚组)。两组间患者年龄、体质量指数(BMI)、基础FSH水平、移植日子宫内膜厚度、内膜准备方案比较均无显著性差异(P>0.05)；两组间临床妊娠率比较无显著差异(P>0.05)，但优质卵裂胚组的活产率显著高于非优质卵裂胚组(P<0.05)，而流产率则显著低于非优质卵裂胚组(P<0.05)(表2)。

表2 不同质量D3卵裂胚来源的优质囊胚移植周期情况比较[(-±s)，%]

3.非优质囊胚移植周期患者一般情况及临床结局：移植非优质囊胚218周期，其中来源于D3优质卵裂胚112周期(优质卵裂胚组)，来源于非优质卵裂胚组106周期(非优质卵裂胚组)。两组间患者年龄、BMI、基础FSH水平、移植日子宫内膜厚度、内膜准备方案比较均无显著性差异(P>0.05)；两组间临床妊娠率无显著性差异(P>0.05)，优质卵裂胚组活产率显著高于非优质卵裂胚组(P<0.05)，而流产率则显著低于非优质卵裂胚组(P<0.05)(表3)。

表3 不同质量D3卵裂胚来源的非优质囊胚移植周期情况比较[(-±s)，%]

三、讨论

虽然目前ART技术已日渐成熟，但其成功率并不十分理想。囊胚移植技术是提升ART成功率的有力手段之一，而选择性单囊胚移植技术则是囊胚移植策略的首选。因此，囊胚的挑选成为影响ART结局的关键因素之一。尽管如今有诸多辅助选择技术，如时差成像技术、胚胎植入前非整倍体遗传学检测(PGT-A)等应用于囊胚的选择，但形态学评估仍然是最主要的筛选方法。经典的Gardner囊胚评分系统根据囊胚腔的大小、内细胞团的细胞数量及形态以及滋养层细胞的数量及形态等3个方面对囊胚进行评级来筛选出具有较高种植潜能的囊胚[4-5]。然而形态学评估也存在着一定的局限性，Barrenetxea等[6]在一项前瞻性对照研究中发现，即便是移植评分完全相同的囊胚，其临床结局也存在较大的差异。这可能是由于单纯的囊胚形态学评估体系不够完善的缘故，也许结合其卵裂胚阶段的综合评估可能更好。

囊胚移植的临床结局与其卵裂胚阶段的胚胎评估究竟有无关联？相关的研究是基于囊胚形态和其所来源的卵裂胚评分的综合评估。Mizobe等[7]的研究显示，卵裂胚时期的碎片比例对其所形成的囊胚移植的临床结局并无显著影响，推测可能与胚胎的自我修复功能有关系。Balaban等[8]认为即便卵裂胚时期评分不佳的胚胎，如果能够形成高质量的囊胚依然可以获得较好的妊娠结局；Almagor等[9]研究表明，D3不规则卵裂的卵裂胚只要能够顺利发育至囊胚阶段就不会影响其种植潜能和临床结局。然而，Borini等[10]的研究认为，卵裂胚阶段的胚胎评估对于其种植潜能具有决定性的预测价值。还有研究发现囊胚移植的临床结局可能与其来源的卵裂胚的评分密切相关[11-12]。以上文献报道表明卵裂胚阶段的胚胎评估与其囊胚的临床结局相关性存在着争议。

众所周知，卵裂胚的形态学评分是评估卵裂胚生长潜能的重要依据。然而在日常的ART工作中我们在囊胚的选择上往往只注重囊胚阶段的评分而忽视了之前的卵裂胚阶段的评分，可能导致在ART中会出现与预期不相符合的临床结局。本研究将我中心单囊胚移植周期的患者先按照移植囊胚的质量进行区分，再按照移植囊胚来源的卵裂胚形态学评估结果将其分成了优质卵裂胚组和非优质卵裂胚组，分别比较分析两组的临床结局。我们的研究结果显示，非优质卵裂胚来源的囊胚其优质囊胚比例显著低于优质卵裂胚来源的囊胚组，这说明7～9细胞的优质卵裂胚获取优质囊胚的可能性明显高于非优质卵裂胚。这与Yu等[13]的研究结果相似。本研究中，尽管不同卵裂胚来源(优质卵裂胚 vs. 非优质卵裂胚)的冻融囊胚移植的临床妊娠率并无显著性差异(移植优质囊胚周期：70.57% vs. 66.67%；移植非优质囊胚周期：62.50% vs. 53.77%；P均>0.05)，但优质卵裂胚来源的冻融囊胚移植组的流产率显著低于非优质卵裂胚来源的冻融囊胚移植组(移植优质囊胚周期：12.77% vs. 26.47%；移植非优质囊胚周期：15.71% vs. 31.58%；P均>0.05)，而活产率则显著高于后者(移植优质囊胚周期：61.56% vs. 49.02%；移植非优质囊胚周期：52.68% vs. 36.79%；P均>0.05)。这说明移植优质卵裂胚来源的冻融囊胚可以获得较好的临床结局，这与史三宝等[14]的研究结果相似。同时我们也注意到，鉴于非优质卵裂胚来源的冻融囊胚移植的高流产率，即便是优质卵裂胚来源的非优质冻融囊胚移植的活产率也不低于非优质卵裂胚来源的优质冻融囊胚(52.68% vs. 49.02%)。这无疑为制订单囊胚冻融移植策略提供了新的参考，即在有非优质卵裂胚来源的优质囊胚的情况下也可以考虑移植优质卵裂胚来源的非优质囊胚。

在本研究中，优质卵裂胚来源囊胚移植的活产率显著高于非优质卵裂胚来源囊胚移植的活产率，提示D3卵裂胚的形态学评估与其所形成的囊胚移植临床结局密切相关。黄柳静等[15]的研究证实，对低评分的D3卵裂胚行囊胚培养后移植所获的活产率只有26.7%。另有研究表明，较低的胚胎形态学评分意味着该胚胎非整倍体率、染色体异常发生率和表观遗传学异常几率大大增加[16-18]。尽管经历了囊胚形成这个自然优选的过程，但其种植潜能仍然不如优质卵裂胚来源的囊胚(如7～9细胞卵裂胚来源的囊胚)。这可能是非优质卵裂胚来源囊胚移植患者的流产率显著高于优质卵裂胚来源囊胚移植患者，进而导致其活产率显著低于后者的合理解释。

本研究的不足之处在于是单中心的回顾性数据分析，缺乏前瞻性的大样本数据研究结果来支持观点。D3卵裂胚的形态学评估对其所来源的囊胚移植临床结局究竟有怎样的影响尚需进一步深入的研究。

综上所述，本研究结果表明，单囊胚冻融移植的临床结局与其所来源D3卵裂胚的形态学评分密切相关；优质D3卵裂胚来源的冻融囊胚相对于其他来源的冻融囊胚移植具有更低的流产率和更高的活产率。优先移植优质D3卵裂胚来源的冻融囊胚能获得更好的临床结局。