抗炎通管汤对慢性输卵管炎模型大鼠EGFR和ICAM-1表达的影响

戴春秀，庄晓苹，叶婉纯，叶人

（1.温州医科大学附属第一医院 中医科，浙江 温州 325015；2.温州市中西医结合医院 病理科，浙江温州 325000；3.温州市中心医院 中医科，浙江 温州 325000）

临床上慢性输卵管炎是导致输卵管不通的主要原因，不仅破坏输卵管内膜，还易导致管腔粘连、闭塞，使输卵管及其周围组织增生纤维化，甚至硬化、扭曲、粘连，最终影响精子、卵子的结合，及受精卵的游走，而引起不孕。据统计我国女性不孕症中，因慢性输卵管炎引起的占23.7%～35.7%[1]。而炎症过程中，不仅表皮生长因子受体（epithelial growth factor receptor，EGFR）的高表达可增强上皮细胞对生长因子的反应性，细胞间黏附分子-1（cell adhesion moieties，ICAM-1）更是对促进白细胞浸润至炎症部位起着重要作用。因此在防治慢性输卵管炎中，调控EGFR、ICAM-1的表达水平是非常必要的。本实验研究抗炎通管汤对慢性输卵管炎模型大鼠EGFR、ICAM-1表达的影响，为中药防治慢性输卵管炎提供依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：雌性SD大鼠60只，42～49日龄，体质量170～210 g，SPF级，购自温州医科大学实验动物中心，动物许可证编号：SYXK（浙）2010-0150。

1.1.2 实验药物：抗炎通管汤：由柴胡10 g、川芎12 g、黄芪10 g、浙贝母10 g、丹参10 g、莪术10 g、白花蛇舌草15 g、皂角刺10 g、败酱草10 g、牡蛎30 g、炙鳖甲10 g、穿山甲3 g、地龙10 g等药物组成，饮片从浙江中医药大学饮片厂购入，由温州医科大学附属第一医院中药房制备。汤剂制成过程：将方中牡蛎、炙鳖甲、穿山甲加入一定量蒸馏水先煎30 min后，加入其余药材一起煎煮，15～20 min后浓缩、过滤至40 mL（抗炎通管汤浓度为3.75 mg/mL），4 ℃冷藏备用。金刚藤颗粒，购自广西润达制药股份有限公司。药物制备方法：在26.7 mL注射用水中溶入7 g/袋颗粒（浓度为0.2625 g/mL）。

1.1.3 菌种及检测试剂：金黄色葡萄球菌（菌种号：FSCC223005）、大肠埃希菌（菌种号：FSCC149006）、乙型溶血性链球菌（菌种号：FSCC225002），自北京东方赛瑞生物技术有限公司购入后，在温州医科大学微生物实验室进行扩增培养。兔抗鼠EGFR多克隆抗体（编号：BA0820）、兔抗鼠ICAM-1多克隆抗体（编号：PB0054）、羊抗兔IgG（编号：BA1039）、SABC免疫组织化学试剂盒（编号：SA1022）、DAB显色试剂盒（编号：AR1022）均由武汉博士德生物工程有限公司提供。荧光定量试剂盒（SYBR Select Master Mix，货号：4472905）购自美国Life Technologies公司，反转录试剂盒（货号：k1622），购自美国Thermo Fisher Scientific公司。试剂Total购自美国Invitrogen公司；组织RNA分离、扩增试剂盒购自上海Ambion公司；并由上海生工生物工程有限公司完成引物设计与合成。

1.2 方法

1.2.1 实验分组：雌性SD大鼠60只，随机数字表法分成正常组、模型组、金刚藤颗粒组、抗炎通管汤（低、中、高剂量）组同，每组10只。正常组：输卵管注射0.9%氯化钠溶液，注射用水灌胃2 mL；模型组：输卵管注射混合菌液，注射用水灌胃2 mL；金刚藤颗粒组：输卵管注射混合菌液，金刚藤颗粒灌胃2 mL；抗炎通管汤（低、中、高剂量）组：输卵管注射混合菌液，分别给予浓度为9.375 g/kg（低剂量）、18.75 g/kg（中剂量）及37.5 g/kg（高剂量）抗炎通管汤灌胃2 mL。各给药组于造模后第11天分别灌胃给药，连续用药20 d。在给药第21天处死大鼠，取双侧输卵管组织。

1.2.2 慢性输卵管炎大鼠模型制备：采用混合菌株接种法[2]制作慢性输卵管炎大鼠模型。按照50 mg/kg 2%戊巴比妥钠剂量要求，腹腔注射麻醉模型大鼠，腹部剪毛，消毒铺巾，逐层开腹，在两侧输卵管处分别注入混合制备菌液（约4麦氏）20 μL，正常组则以0.9%氯化钠溶液20 μL代替，关腹，依次缝合创口。肉眼观察造模后第11天输卵管组织样本，4%多聚甲醛固定，石蜡常规包埋切片，HE染色，观察各标本镜下组织学改变。

1.2.3 检测方法：①免疫组织化学：用4 μm厚度连续切片，进行标本免疫组织化学染色、脱蜡后，用不同浓度的乙醇分别浸泡，蒸馏水洗涤2次；用3%过氧化氢封闭内源性过氧化物酶20 min，洗涤2次，3次浸泡在PBS溶液（每次5 min）；高压锅抗原修复：以0.01 mmol/L枸橼酸钠缓冲液（pH 6.0）作为抗原修复液，置于高压锅出气后2 min快速冷却；浸泡PBS液中3次（每次5 min）；兔抗鼠一抗加入稀释，4 ℃过夜，浸泡PBS液中3次（每次5 min）；羊抗兔二抗滴入，37 ℃孵育30 min，浸泡PBS液中3次（每次5 min）；DAB显色；自来水反复冲洗，苏木素复染，分级乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。以PBS作阴性对照，阳性标本作阳性对照观察。②新鲜组织样本RNA提取及纯化：按照试剂盒要求提取总RNA；RNA溶解：纯化的RNA以60 U/L elution洗脱溶解，分装20 μL用于检测RNA质量和反转录，其余-80 ℃存储备用。③实时荧光定量PCR检测新鲜组织样本中EGFR、ICAM-1表达量：严格按试剂盒使用说明操作，采用SYBR Green I染料法进行。EGFR上游引物序列：5'-CAGTTTTCTCTGGCGGTTGT CG-3'，下游引物序列：5'-TGCAGTCCTTTTCAGCTCTGT TGTT-3'；ICAM-1上游引物序列：5'-CTGGAGAGCACAAA CAGCAGAGAT-3'，下游引物序列：5'-ATGGGAGCTGAAAAG TTGTAGATTC-3'；以β-actin基因为内参，上游引物序列：5'-CTGAACCCTAAGGCCAACCG-3'，下游引物序列：5'-GACCAGAGGCATACAGGGACAA-3'。实验在20 μL系统中开始，各0.5 μL 2×QuantiTect SYBR Green 10 μmol/L的上下游引物、1 μL cDNA样本、8 μL RNA酶灭活水、l0 μL SYBR Green Master Mix。热循环如下：95 ℃、5 min；95 ℃、10 s，60 ℃、20 s，45个循环；25 ℃、5 min，42 ℃、60 min，70 ℃、5 min。

1.2.4 结果解读：①免疫组织化学EGFR和ICAM-1表达位点：细胞质或细胞膜。阳性：胞浆或胞膜褐色颗粒。切片在光镜下测量采用高倍镜选取慢性输卵管炎症组织、正常输卵管组织，统一焦距及光强后进行数码摄像，取5个高倍视野区域，用Image Pro Plus 6.0软件分析，计算叠加阳性区域光密度总量及面积总和，两者相除，得到单位面积平均光密度（OD）值，而相同切片5个视野的光密度均数为片中EGFR、ICAM-1所示的表达强度。②实时荧光定量PCR检测新鲜组织中EGFR、ICAM-1 mRNA表达量：选择合适的基准线，各荧光曲线与准线的交叉点即为Ct值，同一准线下Ct值越小，荧光信号的基因拷贝数也就最早达到一定阈值。用β-actin作为参考基因，利用2-△△Ct方法解释靶基因和参考基因Ct值。大鼠正常输卵管组织作为对照组，EGFR、ICAM-1相对表达公式：folds=2-△△Ct其中△△Ct=（Ct目的基因-Ct内参照基因）研究组-（Ct目的基因-Ct内参照基因）对照组。

1.3 统计学处理方法 采用SPSS16.0软件进行统计学分析。各组数据均为正态分布，用 ±s表示。多组间比较用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD法，方差不齐时则用秩和检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 慢性输卵管炎大鼠模型建立情况 肉眼观察可见输卵管造模组较正常组明显狭窄、质地粗糙变脆、颜色灰白，不同程度粘连，部分输卵管及其周围可见积液或成脓。光镜下病理：造模后经HE染色输卵管组织边界模糊，纤维组织增生，排列紊乱的远端管腔纤毛，近端管壁角质增生，粘连较多，管腔部分不通，可见浆细胞、淋巴细胞及少量嗜酸性粒细胞等浸润全层，见图1。

图1 输卵管组织病理学改变（HE，×200）

2.2 抗炎通管汤对大鼠输卵管上皮细胞EGFR、EGFR mRNA表达的影响 与正常组比，模型组及各给药组EGFR、EGFR mRNA表达均升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比，中、高剂量抗炎通管汤组EGFR、EGFR mRNA表达下降，差异有统计学意义（P＜0.05）；而金刚藤颗粒组、低剂量抗炎通管汤组EGFR、EGFR mRNA表达差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

2.3 抗炎通管汤对大鼠输卵管上皮细胞ICAM-1、ICAM-1 mRNA表达的影响 与正常组比，模型组及各给药组ICAM-1、ICAM-1 mRNA表达均升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比，中、高剂量抗炎通管汤组ICAM-1、ICAM-1 mRNA表达下降，差异均有统计学意义（P＜0.05），而金刚藤颗粒组、低剂量抗炎通管汤组ICAM-1、ICAM-1 mRNA表达差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表1 各组大鼠输卵管上皮细胞EGFR和EGFR mRNA表达量的比较（n=10， ±s）

表2 各组大鼠输卵管上皮细胞ICAM-1、ICAM-1 mRNA表达量比较（n=10， ±s）

3 讨论

慢性输卵管炎在历代中医文献中并无明确病名记载，辩证分析后可以归结为“断绪”“腹痛”“带下病”“癥瘕”[3]等。历代医家对本病的探讨分析，概因浊毒蕴结体内，致气滞血瘀，故不通则痛，出现月经不调、腹痛等症状。治疗上以解毒化浊，行气活血为主，故笔者自拟抗炎通管汤以对症下药。方中皂角刺、白花蛇舌草、败酱草解毒化浊为主药；柴胡归于肝经，长于行气解郁，川芎“气中血药”，行气且能活血止痛，二者共奏行气止痛之功；穿山甲、地龙、丹参、莪术祛瘀活血，通络止痛；牡蛎、鳖甲、浙贝母化痰散结；黄芪固本扶正。全方共奏解毒化浊，通瘀散滞，使冲任调畅，从而实现抗炎通络、调经助孕的目的。

EGFR作为膜表面传感器，在人表皮细胞、基质细胞[4]中广泛表达，具有酪氨酸激酶活性。其介导信号转导的作用往往是多方向的，包括增殖、迁移、细胞分化和稳定内部环境等，以及细胞增殖，恶性肿瘤发生、发展和变化[5]。EGFR表达增强，促使上皮细胞生长因子与受体形成复合物，从而影响上皮细胞和输卵管上皮的增殖、分化，进一步加剧炎症反应。ICAM-1[6]又名CD54，是黏附分子中免疫球蛋白超家族成员，是炎症反应的重要介质，介导了白细胞与内皮细胞黏附过程，并迁移于组织与受损靶细胞结合。在受到如白介素1（interleukin，IL-1）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor，TNF-α）等炎性细胞因子刺激或内毒素等作用后，ICAM-1表达明显增加，进而加快白细胞的趋边滚动和向内皮下基质的游走[7]。本研究结果显示，EGFR和ICAM-1蛋白在正常组输卵管上皮细胞中少量表达，而模型组EGFR、ICAM-1蛋白表达明显升高。通过免疫组织化学和实时荧光定量PCR检测发现，中、高剂量抗炎通管汤组均能降低EGFR、EGFR mRNA、ICAM、ICAM-1 mRNA的表达，且高剂量组下降明显，而低剂量组并不能有效降低其表达；实时荧光定量PCR与免疫组织化学检测指标的结果基本吻合。本研究结果表明EGFR在慢性输卵管炎的发病中起着重要作用，炎性介质及细菌感染均可以上调其表达，而抗炎通管汤能通过抑制其异常表达，发挥抗炎作用；ICAM-1也参与了整个炎症过程，抗炎通管汤通过抑制输卵管组织ICAM-1蛋白的异常表达，阻断或减轻炎症及组织损伤，改善输卵管的结构和功能，且抗炎通管汤的疗效与其浓度具有一定相关性。

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