补阳还五汤对局灶性脑缺血大鼠神经干细胞移植后Bag-1表达的影响

廖亮英，蔡光先，周赛男

(1.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007；2.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208)

补阳还五汤出自清代王清任的《医林改错》，是益气活血法的代表方剂[1]。临床常用于治疗中风后遗症，疗效确切。研究表明，中风恢复期神经功能重建的可能机制与影响神经干细胞凋亡的相关调控基因有关，Bag-1基因是一种新型的、独立的细胞凋亡相关蛋白，是较为肯定的细胞凋亡调控基因[2]，本试验拟选用补阳还五汤为研究对象，通过观察其对局灶性脑缺血大鼠神经干细胞移植后凋亡基因Bag-1的影响作用，探讨其量效关系的特点，为其临床应用剂量提供参考。

1 材料

1.1 药物

补阳还五汤超微饮片与传统饮片，均由湖南省中药超微工程技术研究中心提供，试验前补阳还五汤超微饮片用沸水保温浸泡20 min，补阳还五汤传统饮片按常规方法煎煮，浸泡液与煎煮液按要求配至所需浓度，补阳还五汤传统饮片成人临床日用量为180 g生药。

1.2 试剂

DMEM/F12粉(Hyclon公司)；bFGF(R&D公司)；B27添加物、EGF(GLBCO公司)；胰酶、EDTA、Qtracker Cell Labeling Kit Protocol、 Rabbit Anti-Bag-1抗体(武汉博士德生物工程公司)；细胞凋亡检测试剂盒(长沙丽欣生物公司)；水合氯醛、0.01 MPBS、TritonX-100、双氧水、甲醇、无水甘油(长沙丽欣生物公司)；SABC试剂盒、AEC显色剂、多聚赖氨酸包埋玻片、水溶性封片剂(北京中杉生物公司)。

1.3 动物

SD大鼠80只，清洁级，体质量(280±20)g，雌雄各半，由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供。实验动物生产许可证为SCXK(沪)2003-0002。

1.4 仪器与器械

BX51光学显微镜、图像分析系统、倒置显微镜、CCD摄像头(日本Olympus公司)；CO2培养箱(Shell lab 公司)；鼠脑立体定位仪(四川)；台式离心机(湘仪)；MilliQ超纯水仪(Millopor 公司)；E60冰冻切片机(英国Shamton公司)；贝利粉碎机(济南贝利公司)。

2 方法

2.1 神经干细胞的分离、培养、传代

参考本研究团队建立的方法[3],从新生3～5 d SD大鼠脑内分离纯化。

2.2 模型制备

采用大脑中动脉线栓法复制局灶性脑缺血大鼠模型。待动物清醒24 h后，采用Zea Longa神经功能缺失评分标准初步评价动物造模情况。

2.3 细胞标记

[4]采用量子点的标记方法。

2.4 细胞移植

参考文献[5]采用侧脑室细胞移植方法。

2.5 动物分组与给药

将造模后的SD大鼠按神经功能缺损评分进行分级，随机分为5组：模型组(A组)、M+空白移植组(B组)，M+移植组(C组)，M+移植+补阳传统饮片组(4.57 g/kg，D组)，M+移植+补阳超微饮片组(1.52 g/kg，E组)，每组15只。动物手术后分别观察存活7、14和28 d的情况，每组每个时间点各5只。各组分别灌胃给药，模型组和模型加等体积空白移植组给予等体积生理盐水，给药体积均为10 ml/kg，每天给药1次。

2.6 神经功能评价

参照文献[3]分别于处死前进行神经功能评分，包括9个项目：1)抬起鼠尾观察左前肢屈曲情况；2)同上观察右前肢屈曲情况；3)当前肢在桌面并将鼠尾拦起使后肢抬起向后，观察左后肢屈曲；4)如前观察右后肢屈曲；5)抵抗向左侧的推力；6)抵抗向右侧的推力；7)站立向左倾斜平板的能力；8)站立向右倾斜平板的能力；9)垂直位置。每项按程度计0～4分，共计36分。

2.7 动物处理

动物注射细胞后分别存活7、14、28 d。经10%水合氯醛(1 ml/250 g)麻醉后，沿胸骨左缘剪开胸腔，按文献进行处理，剥离心包，暴露心脏，6号针从心尖插入主动脉，固定针头，剪开右心耳，快速用预冷生理盐水(10 ml/min)，无血污后改滴入4%冷多聚甲醛(5～10 ml/min)，先快后慢，约100 ml。开颅取脑，去额极，小脑，4%多聚甲醛后固定1 h，依次放入15%、20%、30%蔗糖-多聚甲醛液沉底24 h。OTC包埋，冰冻切片机冠状连续切片，15 μm，每隔20张取4张切片。

2.8 免疫组织化学方法检测Bag-1

严格按照试剂说明书完成。阳性细胞计数：AEC显色为红色。单标免疫组化时，细胞呈胞核染色显红色为阳性细胞。单标每个脑片在10×10视野下随机取4个视野，分别计数免疫阳性细胞数。

2.9 统计学方法

所有数据应用SPSS16.0统计软件包进行统计分析，数据分析采用单因素方差分析及组间t检验，所涉及的统计学检验均以P<0.05作为差异有统计学意义标准。

3 结果

3.1 细胞标记情况

在神经干细胞液中加入量子点标记液后，绝大多数神经干细胞被标记，而且由其传代分化的细胞亦被标记。

3.2 补阳还五汤超微饮片与传统饮片对大鼠神经功能积分的影响

与A组比较，C、D、E组在7、14、28 d神经功能积分均明显上升，差异有统计学意义(P<0.01)。与B组比较，C、D、E组在7、14、28 d神经功能积分均明显上升，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。与C组比较，D、E组在7、14、28 d神经功能积分均明显上升，差异有统计学意义(P<0.01)。与D组比较，E组在7、14、28 d神经功能积分均明显上升，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。C、D、E组在7 d、14 d差异有统计学意义(P<0.05)。结果表明，各组动物脑缺血后都存在有一定程度神经功能缺损，但随着缺血时间的逐渐延长，各组动物神经功能积分有所上升。说明各组动物的神经功能在逐步恢复,并且脑缺血后E组促神经功能恢复的效果优于D组，结果见表1。

表1 补阳还五汤超微饮片与传统饮片对大鼠神经功能积分的影响分)

注：组间比较：与A组比较，△P<0.01；与B组比较，＊P<0.05＊＊P<0.01；与C组比较，##P<0.01；与D组比较，★P<0.05，★★P<0.01。组内比较：与7 d比较，▲P<0.05；与14 d比较，☆P<0.05

3.3 补阳还五汤超微饮片与传统饮片对脑缺血后大鼠Bag-1蛋白表达的影响

正常脑组织中Bag-1蛋白为低水平表达，在脑缺血后表达水平逐渐增加。与A组比较，B组在7、14、28 d Bag-1蛋白表达上升不明显，差异无统计学意义(P>0.05)；C、D、E组在7、14、28 d Bag-1蛋白表达均明显上升，差异有统计学意义(P<0.01)。与B组比较，C、D、E组在7、14、28 d Bag-1蛋白表达均明显上升，差异有统计学意义(P<0.01)。与C组比较，D、E组在7、14、28 d Bag-1蛋白表达均明显上升，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。与D组比较，E组在7、14、28 d Bag-1蛋白表达均明显上升，差异有统计学意义(P<0.05)。C、D、E组在7 d、14 d差异有统计学意义(P<0.05)。提示，脑缺血后E组对脑缺血后Bag-1蛋白表达的影响优于D组，结果见表2，图1～3。

表2 补阳还五汤超微饮片与传统饮片对大鼠脑缺血后Bag-1蛋白表达的影响个)

注：组间比较：与A组比较，△P<0.01；与B组比较，＊P<0.01 ；与C组比较，#P<0.05，##P<0.01；与D组比较，★P<0.05。组内比较：与7 d比较，▲P<0.01 ；与14 d比较，☆P<0.01

图1 补阳还五汤超微饮片与其传统饮片对脑缺血后大鼠Bag-1蛋白表达的影响(术后7d)注：A：模型组；B：M+空白移植组；C：M+移植组；D：M+移植+补阳传统饮片4.57 g/kg组；E：M+移植+补阳超微饮片1.52 g/kg组

图2 补阳还五汤超微饮片与其传统饮片对脑缺血后大鼠Bag-1蛋白表达的影响(术后14 d)注：A：模型组；B：M+空白移植组；C：M+移植组；D：M+移植+补阳传统饮片4.57 g/kg组；E：M+移植+补阳超微饮片1.52 g/kg组

图3 补阳还五汤超微饮片与其传统饮片对脑缺血后大鼠Bag-1蛋白表达的影响(术后28 d)注：A：模型组；B：M+空白移植组；C：M+移植组；D：M+移植+补阳传统饮片4.57 g/kg组；E：M+移植+补阳超微饮片1.52 g/kg组

4 讨论

大量实验研究表明，正常成人脑组织中存在神经干细胞(NSCs)，是一种具有自我复制和定向分化潜能的细胞，一般以静止、未增殖状态存在于正常的生理环境中，当脑组织受损时被激活[6]，并受其他因素的调控(如生长因子、神经递质、周围细胞等)。构成神经系统结构和功能的基本单位主要是神经元,定向诱导可促进神经干细胞向神经元分化[7]，而神经干细胞在体外无限增殖，可促使神经受损后神经功能的恢复[8]。所以神经干细胞移植将是治疗神经系统退行性病变或缺失疾病最有效的途径之一。凋亡是一个多基因调控的过程，1995年Takaya ma[9]应用重组人Bcl-2蛋白筛选胚胎c-DNA表达基因库时发现的一种多功能结合蛋白—Bag-1基因，其是一种新型的、独立的细胞凋亡相关蛋白[10]。具有独立抗凋亡的作用，亦可与机体中Bcl-2受体结合，上调其功能，增强细胞抗凋亡能力[11]。

补阳还五汤出自王清任《医林改错》，为补气活血经方，方中重用黄芪大补元气以治本，使气能帅血，更用大量活血化瘀之品(当归、桃仁、红花、赤芍、地龙等)生新以治标，全方补气活血化瘀，标本兼顾。本研究团队及国内其他实验室研究结果表明,补阳还五汤能促进缺血后脑内神经干细胞增殖、迁移、分化[12]，可以阻断细胞凋亡途径，提高新生神经元的成活率[13]，通过调节Bcl-2/Bax、Caspase，减少缺血再灌注损伤神经元凋亡等凋亡因子的表达，这可能是其促进缺血后神经功能恢复机制之一[14]。本文所观察的补阳还五汤超微饮片是导师多年的研究成果，相对于传统饮片具有独特的优势，可以增加溶出，方便吸收，提高生物利用度及药材有效成分的溶出速率，同时也可以更大限度的保留生物活性成分。本实验研究表明，神经干细胞能绝大多数被量子点标记，正常脑内存在一定量的Bag-1蛋白的表达，补阳还五汤能促进神经功能恢复，上调脑缺血损伤后Bag-1蛋白的表达，其量效关系体现在脑缺血后模型加移植加补阳还五汤超微饮片1.52 g/kg对脑缺血后大鼠Bag-1蛋白表达的影响作用优于模型加移植加补阳还五汤传统饮片4.57 g/kg；提示补阳还五汤超微饮片的临床用药剂量可采用其传统饮片临床等效剂量的1/3。

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