人脐带源间充质干细胞对心力衰竭患者PBMC增殖能力的影响

张晶晶 石亚楠

心力衰竭(heart failure, HF)是各种心脏疾病的终末阶段, 目前仍有较高的致死率。既往多项研究发现间充质干细胞(MSCs)在体外能够刺激活化的人的PBMC、鼠的脾脏细胞和分离纯化的CD4+ T细胞产生CD4+CD25+Foxp3+ Treg细胞［1］。陶恩学［2］认为人类MSCs可以通过上调通CD4+CD25+Treg细胞而改变患者的免疫系统从而改善心功能。所以本研究通过观察hUC-MSCs对HF患者PBMC增殖能力的影响,探讨hUC-MSCs对HF的免疫调节作用, 为hUC-MSCs治疗HF提供新的免疫学理论依据。现报告如下。

1　材料与方法

1.1材料 脐带来源：经产妇同意后按照医院规定取自河南省人民医院产科足月健康剖宫产产妇。人外周血来源：经患者同意后按医院规定取自河南省人民医院心血管内科二住院9例HF患者。入选标准：①确诊为HF≥3个月, HF诊断标准参考《中国心力衰竭诊断和治疗指南2014》；②美国纽约心脏病学会(NYHA)分级为Ⅱ～Ⅳ级；③射血分数＜40%。

1.2方法与步骤

1.2.1人脐带源MSCs的分离、培养及鉴定 无菌条件下取脐带标本, 分离出华通氏胶组织后用PBS反复冲洗后剪成大小约1 mm3小碎块, 置于T25培养瓶中培养, 培养至第3代后将细胞消化离心成浓度为≥1×106/ml单细胞悬液, 流式细胞仪检测hUC-MSCs特异性表面抗原。

1.2.2hUC-MSCs生长曲线测定 取第3代hUC-MSCs制成浓度为1×104/ml细胞悬液, 向各孔中加入MTT重新置于培养箱中培养4 h, 后吸去MTT, 在酶联免疫检测仪490 nm处测量各孔细胞的吸光度值A, 连续检测9 d后以天数为横坐标,细胞的吸光度值A为纵坐标, 绘制出hUC-MSCs生长曲线。

1.2.3hUC-MSCs对PHA作用下HF患者PBMC增殖能力的影响

1.2.3.1实验分组 A组：PBMC+PHA；B组：PBMC+PHA+2×105个/ml hUC-MSCs；C组：PBMC+PHA+2×104个/ml hUC-MSCs；D 组：PBMC+PHA+2×103个/ml hUC-MSCs；E组：2×105个 /ml hUC-MSCs；F组：2×104个/ml hUC-MSCs；G组：2×103个 /ml hUC-MSCs。

1.2.3.2实验过程 第3代hUC-MSCs培养箱内培养24 h,PBMC(密度梯度离心法分离出HF患者PBMC)以2×105个/ml接种于丝裂霉素C处理的hUC-MSCs上, 加入PHA以刺激PBMC增殖, 培养72 h后, 加入MTT继续孵育4 h, 在酶联免疫检测仪上于570 nm处测量各孔细胞的吸光度值A, 计算增殖抑制率。增殖抑制率=［对照空白PBMC的A值-(实验孔A值-相同hUC-MSCs浓度空白对照孔A值)］/对照空白PBMC的A值×100%。

1.2.4hUC-MSCs培养上清对PHA作用下的HF患者PBMC增殖能力的影响

1.2.4.1实验分组 A组：RPMI1640完全培养基(含10%FBS)培养组；B组：hUC-MSCs培养上清+RPMI1640完全培养基培养组(1：1)；C 组：hUC-MSCs培养上清 (含10%FBS)培养组。

1.2.4.2实验过程 ①条件培养基配制：将1.5×106个第3代hUC-MSCs细胞接种于T75培养瓶中, 加入15 ml含10%FBS的低糖DMEM完全培养基, 待细胞达80%～90%融合时收集细胞培养上清液。②hUC-MSCs培养上清对PHA作用下的HF患者PBMC增殖能力的影响：按实验分组重悬PBMC, 加入PHA以刺激PBMC增殖培养72 h后, 每孔加入MTT继续孵育4 h, 在酶联免疫检测仪上于570 nm处测量各孔细胞的吸光度值A, 计算增殖抑制率。增殖抑制率=(对照正常培养基培养PBMC的A值-条件培养基培养PBMC的A值)/对照正常培养PBMC的A值×100%。

1.3统计学方法 应用SPSS17.0统计学软件对研究数据进行分析处理。计量资料以均数±标准差表示, 多组间比较采用单因素方差分析, 两组间比较采用独立样本t检验。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2　结果

2.1hUC-MSCs免疫表型鉴定 流式鉴定结果显示CD29、CD44为阳性, CD34、CD45为阴性。

2.2hUC-MSCs生长曲线 MTT检测法的结果显示第3代hUC-MSCs生长情况基本为：第1～2天细胞处于潜伏期。第3～6天开始细胞进入对数生长期, 呈明显的增殖状况, 且生长迅速。第6～7天后细胞进入平台期。

2.3hUC-MSCs对PHA激活的HF患者PBMC增殖能力的影响 多功能酶标仪检测hUC-MSCs对PHA作用下PBMC增殖抑制的结果显示hUC-MSCs对PHA作用下PBMC增殖呈抑制作用, 且此作用呈剂量依赖性, B组、C组、D组增殖抑制率分别为(74.92±1.17)%、(51.56±4.36)%、(25.24±2.24)%, 比较差异具有统计学意义(P＜0.01)。

2.4hUC-MSCs培养上清对PHA激活的HF患者PBMC增殖的影响 多功能酶标仪检测hUC-MSCs条件培养上清对PHA作用下PBMC增殖抑制作用呈剂量依赖性, B组、C组增殖抑制率分别为(25.82±2.26)%、(39.52±4.12)%, 比较差异具有统计学意义(P＜0.01)。

3　讨论

目前许多研究显示, MSCs移植可缓解HF患者临床症状, 改善其心功能［3-6］。本实验中选取hUC-MSCs进行实验, 首先研究了hUC-MSCs对于HF患者PBMC增殖能力的影响, 本实验中首先采取直接接触法培养细胞, 发现hUCMSCs可呈剂量依赖性抑制PHA激活的HF患者PBMC增殖, 当hUC-MSCs与PBMC以1：1相互作用时, 抑制率高达(74.92±1.17)%, 提示细胞与细胞间直接接触在hUC-MSCs对于HF患者的免疫抑制过程中发挥至关重要的作用, 随后采用“未激活”的hUC-MSCs条件培养基培养PHA刺激下的HF患者的PBMC, 发现条件培养基能够抑制PBMC的增殖, 抑制率为(39.52±4.12)%, 虽然其抑制增殖能力较MSCs-PBMC直接接触途径差, 但仍说明hUC-MSCs具有固有免疫分泌能力抑制HF患者PBMC增殖反应, 这与陶恩学［2］的研究是一致的, 具体可能是通过上调CD4+CD25 Treg细胞。有研究表明慢性HF患者存在免疫调节功能受损, 正是通过测定CD4+CD25 Treg细胞水平得出的结论［3］。

综上所述, hUC-MSCs呈剂量依赖性抑制PHA刺激下HF患者PBMC增殖, hUC-MSCs条件培养基同样可抑制此过程, 但抑制程度较轻, 仍提示hUC-MSCs具有固有免疫分泌能力参与此抑制过程, 为hUC-MSCs对HF患者的免疫治疗提供了新的理论依据。

［1］ 何伟刚.CD4+CD25+调节性T细胞与负向免疫调控及免疫耐受.国际肿瘤学杂志, 2006, 33(5)：324-328.

［2］ 陶恩学.骨髓间充质干细胞对鼠心力衰竭CD4+ CD25+ Treg细胞的影响.潍坊医学院学报, 2014(5)：334-336.

［3］ 胡泽平, 王邦宁, 李嘉嘉.慢性心力衰竭患者外周血CD4+CD25+ CD127-调节性T细胞和自然杀伤细胞的变化.安徽医科大学学报 , 2010, 45(1)：98-101.

［4］ 张玉琳, 王静文, 于纪棉.人脐带和骨髓源间充质干细胞对脐血单个核细胞增殖能力的影响.检验医学与临床, 2014(4)：433-435.

［5］ 陈璇.人脐带间充质干细胞培养上清的免疫抑制作用研究.广东药学院, 2014.

［6］ 田甜.人脐带源间充质干细胞对心力衰竭患者CD4+CD25+CD127low调节性T细胞的影响.郑州大学, 2016.