靶向纳米粒超声造影剂的研究进展

庄连婷，黄瑛

（中国医科大学附属盛京医院超声科，沈阳 110004）

超声波成像技术是利用对扫描声束反射信号的接收、处理以获取人体内器官的影像，是一种无创、安全、可靠的成像方式。但由于超声波易受肠气、肺气和骨骼等因素干扰，会导致图像质量不佳。因此，寻找一种能够提高血池显像分辨率、显示组织灌注的成像方法是很多研究者的愿望。20世纪60年代，美国GRAMIAK等［1］首次提出“超声造影”的概念，超声造影技术的出现大大提高了超声血池显像的分辨率，而超声造影技术的关键在于超声造影剂的研究制备。

迄今为止，有关超声造影剂的研究已经有半个世纪之久，超声造影剂的发展主要经历了3个阶段。第一代超声造影剂为游离气体，由于其稳定性差、不能由外周静脉注射，只能用于右心显影，很少应用；第二代超声造影剂为由蛋白质或多糖包裹自由气体的微泡，不仅能经外周静脉注射入人体，还通过肺循环实现左心和外周血管显影，实现了造影剂由有创到无创质的飞跃；第三代造影剂为由脂质或者多聚化合物包裹大分子惰性气体的微泡造影剂［2］，其中大分子惰性气体多为氟碳气体，粒径通常为1～10 μ m，由于其溶解度和弥散度低，体内存留时间长，显影效果好，生物安全性高和相容性好，现已有部分第三代超声造影剂通过食品药品监督管理局 （Food and Drug Administration，FDA） 审核应用于临床，如Sonovue、Definity、Optison等。

第三代超声微泡造影剂的微泡大小是微米级，与红细胞差不多大，而肿瘤新生血管的内皮间隙约为380～780 nm，因此微米级超声微泡造影剂无法通过肿瘤血管间隙实现肿瘤血管显像，仅能用于血池显像；即使将微米级微泡注射入实体肿瘤中，也不能离开脉管系统，反而会引起相应的血管和淋巴管引流不畅。随着超声分子影像学的迅速发展和临床需求的增加，超声造影剂从微米级微泡发展到纳米粒，微泡管径更小、穿透力更强，可以穿过肿瘤血管间隙进入组织［3］。本文主要就靶向纳米粒超声造影剂的研究进展做一综述。

1 纳米粒超声造影剂分类

纳米粒超声造影剂的物理属性与其外膜和内核构成密切相关。

1.1 内核

根据内核的形态不同，分为纳米级微泡和纳米乳超声造影剂。纳米级微泡超声造影剂与第三代超声造影剂构成基本相同，都是由脂质或者多聚化合物包裹大分子惰性气体组成；纳米粒超声造影剂经微米级超声微泡造影剂差速离心法得到［4］，粒径约为490 nm，性质稳定，低温避光保存其粒径和性能可维持达2周；两者不同之处仅是粒径达到纳米级，穿透力更强，能进入肿瘤血管间隙。

与第三代超声造影剂不同之处，纳米乳超声造影剂的内核为氟代氢的脂肪族化合物，其中碳原子数量决定全氟碳的物理属性，碳原子数＜5为气态，≥5为液态；纳米乳超声造影剂内核全氟碳的碳原子数≥5。但全氟戊烷［5］的沸点为29 ℃，注入人体生理状态下即相变为气态，这与超声聚焦特定部位显像相矛盾，因此目前研究使用较多的内核为全氟己烷或过氟辛基溴。全氟己烷和过氟辛基溴沸点高，虽能克服上述存在的问题，但又出现需要更高能量的超声波促使液气相变发生这一问题。有学者［6］发现用氧化铁纳米颗粒作为成核位点，对高沸点的全氟碳进行改性，可以大大降低纳米液滴的沸点，从而解决这一问题。

1.2 外膜

纳米粒超声造影剂根据外膜材料不同，分为脂质纳米粒超声造影剂、高分子纳米粒超声造影剂、液态氟碳纳米粒等。脂质纳米粒超声造影剂是目前研究较成熟的纳米粒超声造影剂，其外膜多为磷脂。磷脂在人体内稳定性好，能够靶向多种炎症标志物，如抗细胞黏附分子1、抗血管黏附分子1、抗纤维蛋白、抗纤维蛋白原以及抗组织因子等。李硕阳等［7］制备了一种载小干扰RNA的脂质纳米级超声微泡造影剂，平均粒径约为400 nm。利用脂质纳米粒超声造影剂可以对肿瘤组织显像，小干扰RNA可以促使肿瘤细胞凋亡，使肿瘤基因沉默，实现肿瘤治疗评估一体化。

高分子纳米粒超声造影剂［8-9］是一种新型超声造影剂，其外膜多为乳酸/羟基乙酸聚合物，乳酸/羟基乙酸聚合物是目前唯一通过FDA审核的外膜高分子材料。骆杰等［10］制备一种载紫杉醇和赫赛汀的高分子纳米级超声微泡造影剂；将其引入乳腺癌细胞中，发现与MCF-7有良好的结合性，这为实现乳腺癌超声分子显像和靶向治疗奠定了基础。

液态氟碳纳米粒［11］是目前报道最多的多功能纳米粒超声造影剂，集成像和治疗于一体；其核心为较稳定的氟碳类液体，液体成分使其对压力和机械应力更具有抵抗性，外壳为可连接配体的脂质或高分子材料；当其游离于血液循环中未到达靶区前，背向散射回声极低，只有聚集于靶区时，超声信号才明显增强，降低背景噪声，提高对比信号；液态氟碳纳米粒平均粒径约为200 nm，体内稳定性好，循环半衰期较长。

2 靶向纳米粒超声造影剂

常规超声造影剂对特定部位没有特异靶向性，包括纳米粒超声造影剂，然而靶向纳米粒超声造影剂可以对特定部位靶向结合，实现精准显像。有文献［3］表明，虽然靶向微米级超声微泡造影剂也具有靶向性，但是肿瘤新生血管间隙小、靶点有限，这就推动了靶向纳米粒超声造影剂的问世。靶向纳米粒超声造影剂是继游离气体、包裹自由气体的白蛋白或多糖微泡和包裹全氟化碳等惰性气体的传统微泡之后的一种新型超声造影剂［4］，其表面连接有针对特定组织特异性受体的配体或是针对特异性抗原的抗体，纳米粒到达靶区后可特异地与病灶相应受体结合，使特定病变部位的超声信号增强，从而实现超声在分子水平的实时精准显像。

2.1 成像分类

靶向纳米粒超声造影剂有2种显像机制［12］，即被动靶向和主动靶向。由于肿瘤血管的高渗透性增强了渗透性和保留率效应，纳米粒有更多可能积聚在肿瘤中，这种结合方式称为被动靶向；靶向纳米粒超声造影剂外壳上的特异性配体与肿瘤组织受体特异性结合称为主动靶向。

2.2 靶向纳米粒超声造影剂的应用

2.2.1 恶性肿瘤化疗药物的传递：自1997年以来，人们一直在研究超声造影剂介导的药物传递，目前最新的研究方向是靶向纳米粒超声造影剂介导的药物传递。传统的药物治疗在对病灶起作用的同时会对病灶周围正常组织产生影响，导致不良反应，影响正常组织功能；而靶向纳米粒超声造影剂不仅能够准确到达特定组织或特定部位实现精准显像，还能提高药物的传递效率。靶向纳米粒超声造影剂介导药物传递的作用基础是超声波引导纳米粒形成细胞膜孔隙、打开细胞间连接或内吞作用以促进药物吸收［5］。靶向纳米粒超声造影剂介导的药物传递主要用于恶性肿瘤的化疗方面。

化疗是一种全身性治疗方式，能够阻止癌细胞增殖、浸润和转移，直至最终消灭癌细胞，其中化疗药的固有毒性对消灭癌细胞至关重要，但这也是产生不良反应的主要原因；而减少不良反应的一种方法就是将化疗药封装在漏出率很低的载体上，同时载体具有在肿瘤组织内迅速释放化疗药的能力，从而减少健康的组织暴露。而设计一种具有这2种对立属性的载体是实现药物传递的主要挑战。将特定部位的载体由稳定的循环状态触发转变为不稳定的释放状态的方法有很多种，可以通过超声波爆裂脂质体和细胞膜 （声致相变［13］） ，也可以通过一定能量的激光辐照发生液气相变 （光致相变［13］） ，还可以通过制备一种内部含有全氟戊烷等氟碳液体的磁性纳米粒，外加交变磁场使磁性成分产热，使液态氟碳发生液气相变 （磁致相变［13］） 。以上3种方法都能够使特定部位的载体快速释放药物，并使其进入附近的细胞，同时超声波的紧密聚焦能力能精确地监控肿瘤组织位置，从而实现了超声成像和治疗一体化。

前列腺癌治疗方案中使用的阿霉素 （doxorubicin，DOX） 是一种细胞非特异性化疗药物，其通过与细胞遗传物质相互作用以消灭肿瘤细胞，但由于具有骨髓抑制性和心脏毒性，不能用于老年患者或者心功能差的患者，因此临床应用受到一定的限制。FAN等［12］将人前列腺癌细胞异种种植于小鼠模型，然后将载DOX的靶向纳米级超声微泡造影剂引入小鼠，实验发现超声介导的载DOX纳米粒破裂释放的DOX能有效抑制前列腺癌细胞的生长。载紫杉醇的靶向纳米粒超声造影剂能体外诱导卵巢癌细胞和乳腺癌细胞凋亡，卵巢癌的盆腔种植性转移可以使用腹腔内注射载药靶向纳米粒超声造影剂治疗。载血管内皮细胞生长因子受体2 （vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR-2） 靶向纳米粒超声造影剂可用于治疗脑胶质瘤，同时也用于开放血脑屏障［14］。PERERA等［15］合成的脂质壳多元纳米粒能通过改变膜的流动性和调节热休克蛋白70的表达，提高不同的肿瘤细胞株对化疗和高热反应的敏感性，从而改善肿瘤射频消融术效果。HU等［16］报道声波穿透α v β 3的靶向纳米粒超声造影剂能暂时减慢血液流动，这有利于治疗区域内药物的持续释放，同时减少的血流量也可以使肿瘤缩小［17］。

有研究［18］发现，肿瘤的淋巴结转移与血管内皮生长因子C （vascular endothelial growth factor C，VEGF-C） 紧密相关，因此阻断VEGF-C/VEGF-2信号传导途径是临床抗肿瘤淋巴转移的良策。叶鸣等［19］采用生物素-亲和素连接法将载阿霉素微泡与抗人VEGFR-3 单克隆抗体相连，使其靶向淋巴管内皮细胞后，可以阻断VEGFR-3 表达，抑制肿瘤诱导的淋巴管内皮细胞增殖，从而在一定程度上能够抗肿瘤淋巴结转移。超声波触发纳米粒破裂、释放阿霉素瞬时提高靶组织药物浓度，一定程度上能局部治疗淋巴结内的转移性肿瘤细胞。

2.2.2 恶性肿瘤基因治疗药物的传递：在乳腺癌患者中，约五分之一左右的癌细胞表面有表皮生长因子受体家族成员HER2表达，而乳腺癌复发和转移与HER2基因的扩增及其蛋白产物的过表达密切相关［20-21］。SONG等［22］采用改良薄膜水化法制备了新型靶向HER2的纳米粒超声造影剂，并对其进行了特异性细胞靶向能力和多模态成像检测，成像结果显示此类纳米粒比其他药物传递方式具有更好的包封药物能力，在体内循环时间更长，具有更好的肿瘤选择能力、杀伤作用等优点。YANG等［23］制备了针对HER2的肿瘤特异性双模纳米粒超声造影剂，利用纳米粒表面的抗肿瘤配体进行肿瘤显像。这一系列研究为乳腺癌患者尤其是HER2阳性乳腺癌患者，提供了更有针对性的治疗方案。近年来，还有学者［24］使用非病毒性制剂 （包括注射DNA、脂质体、多糖、脂多糖、纳米颗粒、基因枪） 和靶向纳米粒超声介导的基因传递用于卵巢癌的基因治疗，这大大改善了卵巢癌患者的预后。

2.2.3 靶向纳米粒超声造影剂用于肿瘤的早期诊断：新生血管的生成是肿瘤发生的重要标志，肿瘤的侵袭和转移更依赖于新生血管的发展，因此根据肿瘤新生血管的分子变化实现肿瘤的早期诊断具有重要意义。目前多将VEGF-2、CD276和整合素α v β 3作为肿瘤血管靶向超声造影剂的靶点。VEGF-2、CD276［25］和整合素α v β 3都是促进血管内皮细胞增殖的因子，这些因子在肿瘤新生血管内皮表面呈特异性高水平表达，而在对应正常组织的血管内皮上呈低表达甚至不表达［26］。BACHAWAL等［27］发现靶向VEGFR-2的纳米粒能够评估早期乳腺导管内原位癌的进展，并能很好地区分良恶性实体肿瘤。卵巢癌的肿瘤相关血管生成与微血管α v β 3整合蛋白的表达增加有关，BARUA等［28］发现使用靶向整合素α v β 3的纳米粒能提高卵巢癌中新生微血管的检出率，这为实现卵巢癌早期诊断的目标提供了一种无创的检测方法。

有文献［29-30］表明，大部分卵巢癌细胞表面过度表达促黄体生成素释放激素类似物 （luteinizing hormone releasing hormone，LHRHa） 受体，而在正常组织或细胞几乎不表达。郭娟等［31］采用生物素-链霉亲和素非共价结合方式制备靶向LHRHa的纳米级超声微泡造影剂，并用荧光标记，以表面存在LHRH受体的卵巢癌细胞A2780/DDP为靶细胞，观察其体外寻靶能力，这也为卵巢癌提供了一种新的诊断方式。

近年来，还有研究者将液态氟碳的液气相变特性和超声反应性材料的吸光特性结合，用激光照射成像部位，部分光能转化为热能导致液态氟碳液气相变发生之后经超声探测器检测到，从而实现靶组织显像。夏琼等［32］制备了包裹金纳米棒-液态氟碳的双模态纳米级超声微泡造影剂，体外显像表现为超声信号增强，这表明光声造影剂具有可行性，为以后的研究奠定基础。目前研究较多的超声反应性材料是纳米金棒；纳米金棒是一种包裹金粒的纳米级超声微泡造影剂，其内核可以载氟碳液体或其他药物或基因，其超声反应性表现为在近红外段808 nm左右有良好的吸收率［33］，呈现高信号，而人体在此段呈现低信号。

3 展望与不足

随着分子影像学的发展，超声造影剂能实现多功能成像和多模态显像。多功能成像不仅能利用超声造影剂进行疾病的诊断，还能载药物、基因等用于疾病的治疗。目前国内外研究较多的是多功能纳米粒，这种多功能纳米粒由多种显像分子、靶向基因及药物与特殊纳米材料连接制备而成，以液态氟碳纳米粒为代表。多模态显像在进行超声分子成像的同时实现其他影像技术增强显像，经过后期处理将各种分子影像学的优点结合，使超声分子影像学得到更好的发展。多模态靶向纳米超声造影剂已经用于结合超声增强造影成像和靶向治疗，在诊断和治疗各种疾病方面具有很大潜力，尤其是针对恶性肿瘤。

经过多年的实验，微米级超声微泡造影剂 （如Sonovue） 已用于临床，但纳米粒超声造影剂尚处于研究阶段，仍存在很多问题：（1） 靶向纳米粒超声造影剂制备技术还不是很成熟，目前大多数研究者使用液态氟碳作为造影剂的核心，其本身存在极低的生物毒性，对其生物安全性仍未知。 （2） 仅对靶向纳米粒超声造影剂的粒径及电位比较了解，脂质被膜是否光滑、到达靶点时是否仍完整包裹内核等，一系列问题还不清楚。 （3） 靶向纳米粒超声造影剂只进入了肿瘤血管，实现了肿瘤血管内显像和治疗，而不是肿瘤组织或细胞水平的诊断和治疗。 （4）液态氟碳纳米粒可经过超声波、激光和外加磁场产生相变，但是其作用机制还不清楚。 （5） 如何克服体内高速血流的剪切力，增加微泡在高速血流下的黏附率，延长微泡显影时间，提高纳米粒形态的稳定性，仍是现阶段存在的问题。 （6） 靶向纳米粒超声造影剂尚未进行临床研究，仅在动物身上进行实验，两者生理环境存在差异，不能有效说明靶向纳米粒超声造影剂的功能特性。 （7） 靶向纳米粒超声造影剂作用效果取决于操作医生的主观意识和临床经验。随着超声分子影像学的发展，或许可以从分子层面完善靶向造影剂的穿透性和稳定性等相关参数属性，为临床疾病的诊治提供新方法。尽管对靶向纳米粒超声造影剂并不完全了解，但是国内外专家进行了一系列临床前研究，这为靶向纳米粒超声造影剂用于临床奠定了坚实的基础。