产金属β-内酰胺酶铜绿假单胞菌分子流行病学特征

李永伟 刘心伟 王志盛 许晓娜 郭孝兰 张小倩

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA），俗称绿脓杆菌，属革兰氏阴性杆菌，是非发酵菌科假单胞菌属的代表菌种，对各种环境具有较强的适应性，可存在于陆地、海洋、动物、植物和人体。PA是与一系列院内感染密切相关的机会性致病菌，可导致住院患者罹患肺炎、尿路感染以及皮肤和软组织感染，是重症监护室、肿瘤科、烧伤科和外科病房常见的病原菌，且多为多重耐药菌株，导致发病率和死亡率升高[1，2]。近年来，由PA引起的囊性纤维化（Cystic Fibrosis，CF）患者的肺部感染引起了人们的重视，由于其可长期存在于CF患者的气道内，导致急性感染迁延为慢性感染，成为临床治疗CF的棘手问题[3]。在针对非发酵菌革兰氏阴性杆菌的监测结果显示，PA在临床上的分离率约占非发酵菌感染50%以上，居非发酵菌引起的感染性疾病首位[4]。

由于PA膜孔蛋白通透性较差，加之外膜蛋白表达减低，造成药物难以到达菌体内部，因此PA对多种抗菌药物天然耐药，其造成的感染治疗成为临床难题[5]。PA耐药机制较为复杂，大致可分为天然耐药机制和获得性耐药机制。野生型PA对氨基青霉素类，氨基青霉素/β-内酰胺酶抑制剂合剂，第一代和第二代头孢菌素天然耐药，但对羧基苄青霉素类（替卡西林、羧苄青霉素），脲基青霉素类（哌拉西林、硫苯咪唑青霉素），第三代和第四代头孢菌素，以及碳青霉烯类和单酰胺类（氨曲南）敏感[6]。获得性耐药机制又可分为酶类机制和非酶类机制，前者主要包括青霉素酶、超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）、头孢菌素酶（AmpC）和碳青霉烯酶（A、B、C、D四类），后者包括外排泵机制，膜孔蛋白缺失机制和青霉素结合蛋白改变机制。

金 属 β-内 酰 胺 酶（metallo β-lactmases，MBL），又称金属酶，是一类活性位点含有金属离子的β-内酰胺酶。这些酶能够有效水解除单酰胺类抗菌药物（氨曲南）以外的几乎所有β-内酰胺酶抗生素，使得致病菌对青霉素、头孢菌素和碳青霉烯类耐药[7]。由于MBL具有保守的金属离子结合位点，需要Zn2+作为该酶的辅助因子，因此，传统的β-内酰胺酶抑制剂（克拉维酸等）对MBL无效，但该酶可被EDTA，菲咯啉和巯基化合物抑制。人类于上世纪60年代中期首次在致病性较低的蜡样芽孢杆菌中发现两种结构较为类似的MBL，该酶为锌离子依赖酶。第三种锌离子依赖的MBL，即青霉素酶，亦于上世纪80年代早期在嗜麦芽假单胞菌中被发现。随后，又分别在嗜水气单胞菌和脆弱拟杆菌发现可以水解亚胺培南的MBL。但上述这些酶均由染色体基因编码，且在临床上呈散发分布，因此并未引起人们的重视[8，9]。2010年《柳叶刀·感染性疾病》杂志对“超级细菌”NDM-1型MBL的报道，更是引起了人们对MBL的高度关注。其实早在1991年日本学者Watanabe等[10]已经首次报道了在PA中分离出由可传播的耐药质粒介导的可水解亚胺培南的β-内酰胺酶，并被证实为金属酶，此即IMP-1，且其所在的结合性质粒可以横向传播给假单胞菌属的其他细菌。与以往出现的PA对亚胺培南的耐药机制不同，这是首次发现由获得性金属β-内酰胺酶引发的PA对亚胺培南耐药，由此拉开了针对携带MBL的PA进行研究的大幕。随后又在脆弱拟杆菌中发现了MBL，两年后，又在日本冈崎分离出的粘质沙雷菌中发现该酶，这意味着MBL由单株散发向随机分布过渡，各菌株之间的横向传播成为可能[11，12]。

根据Almber关于β-内酰胺酶的生物学分类法，MBL属于B组β-内酰胺酶，属于A组碳青霉烯酶。而根据B-J-M功能分类法，MBL则属于3群中的碳青霉烯酶，这也是目前推荐的β-内酰胺酶分类系统，但对MBL未做进一步区分。随着金属酶报道的增多，Bush等将MBL分成三个亚群，即3a、3b和3c，目前所发现的MBL绝大多数属于3a亚群，3b和3c亚群仅存在于特定菌属和菌种。3a亚群MBL的特点是底物谱较宽，水解青霉素的速度与水解亚胺培南的速度相近或更快，还能有效水解头孢菌素，故也是β-内酰胺酶中最危险的一种。基于氨基酸序列的相似性，MBL又被分成三个类B1、B2和B3。B1亚类的酶序列相似度超过23%，这些酶包括来自枯草芽孢菌的Bc-Ⅱ酶，来自脆弱拟杆菌的CcrA酶，金黄杆菌的BlaB酶，短稳杆菌的EBR-1酶，从铜绿假单胞菌、黏质沙雷氏菌、肺炎克雷伯菌和鲍曼不动杆菌中分离得到获得性的IMP型金属β-内酰胺酶，以及从铜绿假单胞菌产生的VIM型及SPM型等。由MBL导致的PA对亚胺培南耐药呈逐年增加趋势，在巴西因MBL导致的亚胺培南耐药率达到43.9%，在意大利则达到39.1%，这说明MBL机制已经成为仅次于膜孔蛋白缺失机制的第二位亚胺培南耐药机制[13]。各种类型MBL的不断出现，给院内感染的治疗带来新的挑战，因为产MBL的PA均为多耐药或泛耐药菌株，可对β-内酰胺类，青霉素类，头孢菌素类，氨基糖甙类和喹诺酮类耐药。与MBL阴性的PA相比，MBL阳性的PA菌株可导致院内感染发病率升高，同时是引起死亡率升高的重要因素[14，15]。

在基因水平对MBL进行深入研究，使研究者对MBL的多样性有了更加清晰认识，目前已经发现的与PA相关的MBL基因型主要有：blaIMP、blaVIM、blaSPM、blaGIM、blaNDM、blaAIM和blaFIM。本研究将就有关编码MBL的基因型现状进行综述。

1 IMP型PA

blaIMP是第一个见于报道的获得性MBL编码基因，也是亚洲地区最常见基因型，由日本学者Watanabe等从一株1988年分离的铜绿假单胞菌GN17203获得，即IMP-1型MBL。该酶属于B1亚类，分子量约为28 000，等电点为9.0，其底物谱较宽，可水解亚胺培南，氧亚氨基类头孢菌素和7-甲氧基头孢菌素。酶活性不被β-内酰胺酶抑制剂克拉维酸和舒巴坦所抑制，但可被硫酸铜、氯化汞、乙二胺四乙酸盐（EDTA-K2）和碘剂抑制。其编码质粒大小为31-MDa，耐药性可横向传播给其他铜绿假单胞菌，但不传播给大肠埃希菌[10]。迄今为止，已发现IMP的亚种多达51种，大部分位于Ⅰ类整合子中，其中在PA中发现的有33种[16]，分别为：IMP-1，2，4，5，6，7，8，9，10，11，13，14，15，16，18，19，20，21，22，25，26，29，30，31，33，35，37，40，41，43，44，45，48。它们之间氨基酸序列的相似率从90%～99%不等，水解活性相当，均可以移动基因盒的形式插入至Ⅰ类整合子中[17]。在国内最早发现的是IMP-1，随后又相继发现IMP-4、IMP-6、IMP-9、IMP-25和IMP-45，其中IMP-6与IMP-1相比，存在一个S262G位置的序列突变，且也是首次在日本出现，可认为是前者的变种。不同的是IMP-1对亚胺培南和其他多种抗生素耐药，而IMP-6对新型的碳青霉烯类抗生素如美罗培南和多利培南耐药。而在广州首次分离出的IMP-25与IMP-6相比，存在一个G235S位点突变，与IMP-1存在S262G和G235S两个位点的突变，可以认为是IMP-1和IMP-6的变种，其进化路径为IMP-1→IMP-6→IMP-25，对美罗培南的耐药性呈递增趋势，IMP-25对美罗培南的耐药性强于前两者，可认为是其适应新型碳青霉烯类抗生素暴露演化而来[17～23]。从地理分布来看，IMP型MBL已由最初在东亚的日本、韩国和中国播散至欧洲的德国、英国、法国和比利时，在美洲和澳洲及东南亚各国，是影响范围最广的一种。

2 VIM型PA

blaVIM于1999年首次在意大利北部城市维罗纳大学的一所教学医院收治的一位意大利住院患者的创面分泌物中分离而来，即VIM-1。这株铜绿假单胞菌对所有β-内酰胺类抗生素耐药，包括氨苄西林、羧苄西林、哌拉西林、硫苯咪唑青霉素、头孢噻肟、头孢西丁、头孢他啶、头孢哌酮、头孢吡肟、碳青霉烯类和氨曲南耐药，较为特别的是其对亚胺培南的最小抑菌浓度（MIC）超过128μg/ml，其活性可被乙二胺四乙酸盐（EDTA）抑制。VIM-1型MBL属于B1亚类，具有较为较宽的底物谱，与Bc-Ⅱ同源性较高，保留了和Bc-Ⅱ和CcrA相似的锌离子活性中心，与IMP-1型，CcrA，BlaB和L1型MBL具有相似的水解活性，可以增强广谱β-内酰胺酶在微生物宿主中的耐药性，但氨基酸同质性低于40%[24，25]。随后又在希腊发现了VIM-1型的肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌[26，27]。目前已报道的VIM亚型多达46种，其中在PA中发现24种，分别为 VIM-1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，13，14，15，16，17，18，20，28，30，36，36，37，38和最近在美国发现的VIM-43[16]。分布最为广泛的亚型是VIM-2，遍布亚、欧、非三大洲，由最初的意大利、希腊等南欧国家播散至日本、韩国、法国、葡萄牙、波兰、智利、阿根廷和美国，已经导致多次院内感染流行[17]。VIM-2首次鉴定自法国1例由PA引起的、粒细胞减少患者的血流感染，它对除氨曲南以外的绝大多数的β-内酰胺类抗生素耐药，包括头孢他啶、头孢吡肟和亚胺培南[28]。VIM-2包含266个氨基酸，质量29.4kDa，pI=5.6，与Bc-Ⅱ氨基酸一致性达到32%，与 IMP-1，CcrA，BlaB，NDM-1分别为 31%，27%，24%，24%[29]。VIM-2与VIM-1的氨基酸一致性可达90%，其耐药基因位于仅存在于VIM-2的Ⅰ类整合子上，质粒大小为21800bp，被命名为pNOR-2000，可传递给其它PA[30]。VIM型MBL的同源性≥90%，与IMP型之间氨基酸序列的一致性＜40%，但动力学性质相似，耐药基因大部分位于Ⅰ类整合子上[31]。目前，在中国大陆发现的有关PA的MBL基因型主要是VIM-2，2001年台湾学者Yan Jing-Jou等报道了在临床分离的PA株发现了新型VIM-2的变种VIM-3，与VIM-2相比，二者仅有2个核苷酸不同，导致2个氨基酸发生改变，其耐药基因存在于染色体上，VIM-2及其变种VIM-3已经成为台湾地区MBL流行的主要基因型[32]。

3 SPM型PA

SPM-1于2001年首次分离自巴西圣保罗的一名四岁的白血病女孩的血流感染中，菌株编号48-1997A，该PA株对除多粘菌素意外的所有抗生素耐药，为多重耐药菌株。SPM-1与以往发现的IMP和VIM有很大不同，是一个全新的MBL家族，与IMP-1的氨基酸同源性达到35.5%[33]。介导SPM-1的基因组件是一个普通的局部基因组件ISCR4，既不是染色体，也不是质粒，也非转座子或整合子[34]。有趣的是，从巴西不同地区分离的PA株，虽然其blaSPM高度一致，但其内部的基因组件却各不相同。SPM-1较为理想的底物是青霉素类和头孢菌素类，且结合头孢菌素类较青霉素类更加牢固。和IMP-1和VIM-1类似，SPM-1不水解克拉维酸和氨曲南，可作为竞争性抑制物[35]。目前SPM-1多重耐药PA的出现仅局限于巴西国内，除了1位曾在巴西就医的瑞典人除外，其他国家尚未发现SPM-1[36，37]。目前，南美的碳青霉烯类耐药率位居世界之最，在假单胞菌属和不动杆菌均属中存在的SPM-1型MBL是导致南美碳青霉烯类高耐药水平的重要因素[38]。

4 GIM型PA

2002年在德国杜赛尔多夫大学医院的ICU病房共收集到5株对碳青霉烯类耐药的PA菌株，药敏试验显示，其耐药模式高度一致，尤其是对亚胺培南、美罗培南、头孢他啶、头孢吡肟和哌拉西林-他唑巴坦高度耐药，只对多粘菌素B敏感。MBL初筛试验证实，这5株PA均产生MBL，但使用blaIMP，blaVIM和blaSPM均未获得相应的扩增产物，后续试验证明新型MBL基因型的诞生，即GIM-1。氨基酸分析显示，GIM-1与IMP，VIM和SPM型MBL同源性不超过45%，酶动力学试验显示，与IMP-1较为接近，且对亚胺培南和美罗培南的水解活性较为接近，这也是与之前所发现MBL的不同之处。GIM-1也存在Ⅰ类整合子中，In77，所在质粒较小，大小为22kb，属非结合性质粒，人们一度推定认为，具有特定的宿主，不能通过结合转移的方式传递给其他细菌[39]。2012年又在距离杜赛尔多夫半径40km的几个城市发现5株GIM-1型对碳青霉烯类耐药的PA，以ATCC27853和NCTC10662作为受体进行的结合转移试验未获得成功，印证了GIM-1只能局限于部分区域传播[40]。然而，2013年在阴沟肠杆菌、恶臭假单胞菌、粘质沙雷菌、大肠埃希菌、产酸克雷伯菌和弗氏柠檬酸杆菌陆续发现GIM-1，打破了这一观点，这说明GIM-1可能会以转座子，整合元件或结合元件的方式横向传播给同菌属或不同菌属的其他细菌。针对Ⅰ类整合子的分子结构分析显示，大多数blaGIM-1基因盒具有相同的元件aacA4，aadA1和blaOXA-2，这说明以上元件在横向传播的过程中携带着大量的遗传信息[41]。截至目前，尚未在德国以外的国家和地区发现GIM-1的踪迹。

5 NDM型PA

NDM-1首次进入人们的视野在2009年，来自于引起1名在印度新德里有过居留史的瑞典人的尿路感染，对碳青霉烯类耐药的1株肺炎克雷伯菌[42]。后来《柳叶刀·感染性疾病》又报道在印度、巴基斯坦和英国大量检出NDM-1阳性的肠杆菌科细菌，很多致病菌几乎对所有抗生素耐药，感染者面临无药可用的局面。由于NDM-1由质粒介导，其横向传播造成的院内感染暴发流行，引起了人们的担忧[43]。目前，除NDM-1外，发现了13个NDM系列亚种，即NDM-2至NDM-14，已分别在铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、阴沟肠杆菌、产气肠杆菌、洛菲不动杆菌和大肠埃希菌中发现。NDM-1型PA于2011年在塞尔维亚首次被检出并报道，同时检出两株NDM-1阳性的PA，它们同时对亚胺培南和美罗培南耐药，MIC均大于32μg/ml，基因测序证实与之前在肺炎克雷伯菌中发现的blaNDM-1完全一致，属于B1亚类，这意味着blaNDM-1已经突破肠杆菌科范围向其他菌属传播[44]。次年在法国，从1位之前在塞尔维亚接受过住院治疗的患者体内也检出了NDM-1型PA[45，46]。至此以后，NDM-1型PA在全世界陆续被发现，包括意大利、埃及和斯洛伐克，但与在印度发现的有所不同，其编码基因位于染色体上[47～50]。2015年在新加坡发现3株NDM-1阳性的PA，这也是首次在东南亚地区发现NDM-1型PA，也意味着由南亚和欧美地区向东南亚蔓延[51]。在中国，台湾学者Wu等[52]首先在2010年报道了NDM-1型肺炎克雷伯菌，2013年南昌大学第二附属医院Hu等[53]也报道检出了NDM-1型肺炎克雷伯菌，同年，北京广安门医院[54]又报道分离出国内第一株NDM-1型大肠埃希菌，这说明NDM-1在国内有散发传播趋势。2014和2015年，大陆学者又分别在肺炎克雷伯菌和洛菲不动杆菌中发现了NDM的变种NDM-9和NDM-14，但尚未在国内出现任何NDM型PA的报道[55，56]。NDM-1的传入，以及其新变种在国内的出现，引发了学者对国内院内感染防治的担忧，因为质粒介导的NDM系列编码基因可能会横向传播至顽固耐药的PA。

6 AIM型PA

AIM-1于2012年首次在南澳大利亚城市阿德莱德市分离的3株PA中发现，它们的耐药模式高度一致，对亚胺培南的MIC达到512μg/ml，被认为是同一克隆株。MBL表型筛选均为阳性，但未发现任何之前已报道的MBL基因（包括blaIMP、blaVIM、blaSPM-1、blaGIM-1、blaSIM-1、blaDIM-1和blaNDM-1），出现了一种新型的MBL，命名为AIM-1（Adelaide Imipenemase） 。氨基酸和核苷酸序列分析显示，AIM-1与THIN型和L1型MBL具有高度同源性，属于B3亚类，由染色体介导，而非Ⅰ类整合子，这也改变了学术界有关MBL大多数MBL属于B1亚类的认识。与其他B3类MBL不同的是，AIM-1的耐药基因是一种可移动的移动基因元件ISCR15，可在SPM-1和NDM-1以及AIM-1三者之间相互传递。酶动力学试验显示，AIM-1可水解除氨曲南和克拉维酸之外的大多数β-内酰胺类抗菌制剂，除了头孢他啶外，其动力学参数与L1一致[57]。与其他MBL相比，虽然AIM-1具有很高的Kcat值，具有高效的针对碳青霉烯类的水解活性，但使用大肠埃希菌的结合转移试验证明，这种耐药性并不能传递给受体菌，这与之前有关IMP和VIM的报道一致[17]。AIM-1的晶体结构显示，AIM-1是B3亚类的MBL中第一个被发现携带移动基因元件的MBL；与其他B3亚类相比，AIM-1底物的绑定位点是较窄，也是较为局限的，这也揭示了AIM-1对碳青霉烯类具有高效水解活性的原因[58]。目前，除首例报道外，尚未发现其他国家和地区出现有关AIM-1型PA株及其变种的有关报道。

7 FIM型PA

2012年，意大利弗洛伦萨大学医院的工作人员从2007年分离的1株多重耐药PA株中发现了一种新型的MBL，命名为FIM-1（Florence Imipennemase）。这株PA来自于一名血管移植物引发的血流感染者，且其一直在意大利居住，没有旅游史。药敏结果显示，该菌株对除粘菌素以外的所有抗菌制剂耐药，美罗培南-EDTA联合试验和碳青霉烯酶试验证实，属于产MBL的PA株。PCR扩增试验，未发现之前已被报道的任何MBL基因，是一种新型MBL。MLST试验揭示，FIM-1属于与MBL传播密切相关的ST-235基因家族，是高风险多重耐药基因的典型代表。FIM-1属于MBL的B1亚类，与已知的MBL中结构最为接近的是NDM-1，氨基酸同源性达到40%，其编码基因可插入到染色体中，基因元件ISCR19可能参与了该MBL基因的捕获和移动，但其来源尚属未知。酶动力学参数显示，FIM-1具有较宽的水解底物谱，尤其对青霉素类和碳青霉烯类具有特殊的催化能力，但不水解氨曲南[59]。目前，除首例报道外，亦未发现其他有关FIM-1型PA及其变种的报道。

产金属β-内酰胺酶铜绿假单胞菌（Metalloβ-lactamase-producing Pseudomonas，MPPA）的 出现和传播，造成院内感染的发病率和死亡率升高，已经成为全球性的威胁，这不仅仅是针对免疫缺陷患者而言，也包括社区健康人群。作为一种重要的病原菌，其耐药特性与病原性已呈并驾齐驱之势。虽然目前已经对影响耐药菌株增殖的有关因子，包括突变导致的自然基因多态性、水平层面的基因转移、国际旅行的增多和患者频繁往返于两个国家都增加了耐药菌株传播的可能，以及免疫缺陷患者接受各种侵入性检查和治疗手段实施所面临的巨大的抗生素选择压力等研究较为深入，但往往具有不可控性。因此，积极致力于有关MPPA的分子流行病学监测、耐药机制、严格规范的抗生素合理使用和快速诊断方法的研究以及新型抗生素的研发已成为控制MPPA在世界范围内暴发流行的当务之急。

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