乳及乳制品中β-内酰胺酶常用检测方法

陈少华，肖幸宇，刘凤银

（广东第二师范学院生物与食品工程学院，广东广州 510303）

β-内酰胺酶是一类水解酶，可以催化水解β-内酰胺类抗生素，导致抗生素失去抑菌活性。鉴于此，一些不法商贩为了追求经济利益，没有严格遵守休药期的规定进行采奶，导致牛奶中抗生素的残留，为了躲避检查，人为添加β-内酰胺酶，营造“无抗奶”的假象。β-内酰胺酶缺少安全性评价，其加入增加了乳品行业安全风险，因此针对乳及乳制品中β-内酰胺酶的检测非常重要。目前尚未制定国家检测标准，仅在《生乳中β-内酰胺酶的测定》（NY/T 3313—2018）中规定了生乳中β-内酰胺酶的测定方法——杯碟法[1]。本文主要从乳及乳制品中β-内酰胺酶的稳定性、残留危害、残留现状和检测方法进行阐述，分析常用检测方法的优势与劣势，旨在为选择乳及乳制品中β-内酰胺酶的检测方法提供参考依据。

1 乳及乳制品中β-内酰胺酶的稳定性、残留危害和残留现状

1.1 乳及乳制品中β-内酰胺酶的稳定性

β-内酰胺酶具有较强的耐热性和酸碱耐受性，市售牛奶大多采用巴氏灭菌或超高温瞬时灭菌，贮存于低温或常温条件下，在该加工工艺和贮存条件下并不能使牛奶中β-内酰胺酶完全失活，仍会有β-内酰胺酶残留。

范美婧等[2]探究了牛奶中β-内酰胺酶的稳定性，采用青霉素酶活性检测试剂盒，从牛奶的保存时间、灭菌方法和酸碱处理3个方面对β-内酰胺酶活性的影响进行研究。实验结果表明，低温条件对酶活性影响不大，≤4 ℃贮存一周仍能检出各个浓度的β-内酰胺酶；常温条件下，牛奶放置时间越长，酶活性越小，且减少程度与贮存温度呈正相关关系，25 ℃和37 ℃条件下牛奶样品贮存一周，酶活性降低；长时间高温加热会掩盖低浓度β-内酰胺酶的检出，巴氏灭菌和超高瞬时灭菌等常规灭菌方法并不能使β-内酰胺酸碱完全失活；市售酸奶pH为4～5，酸碱处理均会抑制低浓度β-内酰胺酶的活性，但未完全失活，当β-内酰胺酶浓度＞3 U/mL时仍能检出，pH为6和7时最为稳定。

1.2 乳及乳制品中β-内酰胺酶的残留危害

①乳及乳制品中β-内酰胺酶添加来源不明确，缺乏安全评价数据，这对我国乳及乳制品的质量管理埋下了安全隐患；②β-内酰胺酶水解抗生素生成的青霉噻唑酸分解产物具有细胞毒性，抑制细胞繁殖能力，残留产物会在肝脏蓄积，成为潜在的健康风险；③非法加入β-内酰胺酶掩盖抗生素超标的现实，不仅极易造成奶制品市场抗生素使用泛滥，而且增加了耐药基因的水平和纵向传播风险，使人们抵抗传染病能力下降、肠道菌群紊乱，从而对人体健康造成危害。

1.3 乳制品中β-内酰胺酶的残留现状

2008年卫生部发布的《食品中可能违法添加的非食用性物质名单》中将β-内酰胺酶列为重点监控指标。各个地区的乳及乳制品检测中均有不同程度的β-内酰胺酶残留，部分地区β-内酰胺酶的检出率较高，因此加强乳及乳制品中残留的β-内酰胺酶监管力度，定期执行检测任务至关重要。

齐欣等[3]（2021）采用杯碟法对辽宁省原料乳进行检测，结果186批次样品中β-内酰胺酶的检出率为12.4%；邱正勇（2019）等[4]采用胶体金检测法对河南省郑州市每月采集的60份生乳进行检测，结果β-内酰胺酶检出率波动较大，部分高达73.3%；秦婧[5]（2016）对陕西省149份生鲜乳进行检测，其阳性检出率为11.4%；候海燕（2015）[6]对江苏省淮安市149份牛奶样品进行检测，其阳性率为16.8%。

2 乳及制品中β-内酰胺酶常用检测方法

2.1 微生物分析法

杯碟法检测牛奶中β-内酰胺酶的方法已经较为成熟，该法采用对青霉素敏感的藤黄微球菌，利用舒巴坦能够特异性抑制β-内酰胺酶的活性的性质，以青霉素作为对照，通过比较加入舒巴坦和未加入舒巴坦产生的抑菌圈大小，从而间接测定牛奶中是否含有β-内酰胺酶。

《生乳中β-内酰胺酶的测定》（NY/T 3313—2018）农业行业标准规定了生乳中β-内酰胺酶测定方法杯碟法[1]，其检出限为生牛乳4 U/mL、生羊乳3 U/mL；刘旸等[7]研究两种添加藤黄微球菌的方法对牛奶中β-内酰胺酶检出限的影响，方法1制备成15 cm厚的单层培养基，方法2制备成双层培养基。实验发现方法2其抑菌圈边缘更加清晰，便于观察和测量，该方法灵敏度更高，其检出限在0.000 05～0.00 01 U/mL。

杯碟法是我国乳品行业认可的常用微生物检测方法，成本低，适用大批量检测，检测结果相对准确，但实验过程烦琐，周期长，容易出现假阳性现象，不能进行定量实验，对环境要求较高，不适用现场检测，具有一定的局限性。

2.2 仪器检测方法

2.2.1 高效液相色谱法

β-内酰胺酶能酶解青霉素，且青霉素浓度的减少量与酶活性呈线性关系，因此可以通过测定青霉素浓度减少量来间接检测β-内酰胺酶的含量。基于此原理，李雪芳等[8-9]通过离心除脂、无水乙醇除蛋白，采用高效液相色谱法测定了奶粉中β-内酰胺酶的含量，当β-内酰胺酶浓度在0.2～1.4 mg/L，与青霉素钾的减少量呈现较好的线性关系，回收率89.0%～95.0%，相对标准偏差3.0%～3.5%。

高效液相色谱法因其高灵敏度和高回收率得到广泛应用，但样品前处理较为烦琐，检测成本高，常用于实验室检测，不适合现场高通量检测。

2.2.2 分光光度法

利用β-内酰胺酶水解β-内酰胺类抗生素，其主要产物青霉噻唑酸具有还原性的性质，李滨等[10]建立检测牛奶中β-内酰胺酶的硫酸铜-紫外分光光度法，按照1∶1的比例加入三氯乙酸，辅以冷冻离心沉淀蛋白后，其最低检出限为5 U/mL；戴兴德等[11]基于青霉素分子的硫原子具有还原性，能将Fe3+还原成Fe2+，与[Fe(CN)6]3-生成可溶性普鲁士蓝，而酶水解产物和碱水解产物青霉素噻唑酸均不能与Fe3+反应，具有选择性。利用该原理，建立检测牛奶中β-内酰胺酶含量的普鲁士蓝显色光度法，该方法耗时短，仅35 min，β-内酰胺酶在4～24 U/mL与吸光值呈线性关系，检出限为0.32 U/mL，加标回收率为98.8%～101.2%。

分光光度法具有设备简单、维修方便、操作简单、实用性广、准确度和精密度好等优点，但提高其方法的选择性和降低检出限，一直是遏待解决的问题。

2.3 快速测定方法

β-内酰胺酶能水解青霉素，通过间接竞争法快速测定与β-内酰胺酶反应后残留青霉素的含量，从而间接检测出β-内酰胺酶的含量。

利用青霉噻唑酸能还原Cu2+为Cu+，与2，2-联喹啉生成紫红色络合物的性质，施春煜[12]将醋酸纤维素膜浸泡于亚铜试剂溶液中，真空干燥制成显色层，将过滤层、显色层和吸收材料粘贴在基板上，制成检测牛奶中β-内酰胺酶半定量快速测试纸，再结合分光测定仪制作标准比色卡，该方法最低检出限为6 U/mL，相对误差范围为7.51%～15.38%；张威等[13]采用Charm Rosa β-内酰胺酶试剂盒对150批乳及乳制品进行批量筛查，其检出限为4 U/mL，假阳性率为2%，灵敏度100%，特异性97.8%，具有高灵敏度和特异性，符合试剂盒快速筛查检测要求。

快速测试法具有较高的灵敏度，操作简单，检测速度快，基本能满足大批量筛选的要求，但容易出现假阳性，需结合杯碟法进一步验证。