不同储藏条件下河蟹生物胺及品质变化研究*

刘小莉 彭欢欢 赵江涛 夏秀东 刘 源 周剑忠*

1（江苏省农业科学院农产品加工研究所，江苏南京210014）

2（上海海洋大学食品学院，上海201306）

中华绒螯蟹是一种经济蟹类，又称河蟹、毛蟹、清水蟹、大闸蟹，味道鲜美，营养丰富，是我国及东南亚地区人们十分钟爱的淡水水产珍品，食用价值和经济价值极高，成为特种水产品中最具代表性和最有影响力的主导产业，以江苏为例，超百亿的“螃蟹经济”已占江苏省水产品产值的40%以上。

由于河蟹是季节性非常强的水产品，只有在每年的农历秋冬之际蟹才膏肥黄满。河蟹集中上市季节，市场上经常出现大量积压河蟹，根据民间传统说法，河蟹一旦死亡便失去食用价值，严重影响河蟹产业经济效益的提高。因此改变目前市场上单纯供应鲜活河蟹的鲜销方式，推进河蟹的储藏和加工，对河蟹养殖业健康稳定发展具有重要意义。

对于死亡河蟹不能食用的原因，解释也不尽相同。有学者认为河蟹死亡初期体内会产生致病产物“肉毒碱”，但对肉毒碱的具体成分未见报道，也有学者认为死蟹失去食用价值，是因为河蟹为杂食性动物，以各种鱼、虾、螺、蚌、蠕虫、蚯蚓、昆虫及其幼虫等为食物，因此体内含有大量的细菌，河蟹一旦死亡，体内的细菌就会大量繁殖，分解蟹肉，产生大量有毒生物胺，引起人体中毒。

目前，对于河蟹自然死亡后初期生物胺的变化有一些初步的研究和检测。但对于企业用于加工的河蟹在较长储货期内是否安全，还没有详细报道。本研究采用高效液相色谱法研究室温自然死亡、-40℃速冻后-20℃冻藏条件下的河蟹生物胺含量的变化，并结合pH值、挥发性盐基氮（TVB-N）、游离氨基酸等指标分析河蟹相关品质的变化，从而为评价用于加工的冻藏河蟹的食品安全提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲜活公河蟹，由常熟市金唐市水产有限公司提供，体质量150 g±15 g，由江苏省淡水水产研究所鉴定为中华绒螯蟹。

BCA法蛋白定量测试盒，南京建成生物工程研究所；色胺（Try）、腐胺（Put）、尸胺（Cad）、组胺（His）、酪胺（Tyr）、精胺（Spd）、亚精胺（Spe）标准品，sigma公司；氨基酸混合标样，日本和光公司；丹磺酰氯、丙酮、乙腈（色谱纯），南京化学试剂股份有限公司；其他试剂，均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

T25匀质分散机，德国IKA公司；SevenEasy plus pH仪，上海雷磁仪器厂；Waters 2096高效液相色谱仪，美国Waters公司；DW-150低温试验箱，南京泰斯特试验设备；DW-4 OL 278医用低温保存箱，海尔集团；L-8900氨基酸全自动分析仪，日本日立公司。

1.3 试验方法

1.3.1 原料处理

鲜活河蟹用自来水冲洗干净后沥水，分组，分别进行处理：

1）自然死亡组：将河蟹直接置于室温条件（25℃±3℃）下，至自然死亡；

2）冷冻储藏组：设置低温试验箱温度为-40℃，待腔体温度稳定至设定值后，将温度探头插入河蟹腹部中心进行冻结至中心温度达-20℃以下，将冻结好的河蟹装入保鲜自封袋（厚度0.2 mm），封口，-20℃低温保存箱中储藏。

定期取样，于4℃冰箱中解冻后去除不可食部分，取河蟹腹部及足钳内肉，用于指标测定。

1.3.2 pH值的测定

取蟹肉5 g，加入9倍体积（45 mL）煮沸冷却后的纯水，10 000 r/min匀浆30 s，10 000 r/min离心10 min，测定pH值。

1.3.3 挥发性盐基氮（TVB-N）的检测

采用GB/T 5009.44—2003半微量定氮法进行测定，略有改动。取样品5 g，加入20 mL 5%高氯酸，10 000 r/min匀浆30 s，10 000 r/min离心10 min，取上清液。沉淀中再加入20 mL高氯酸重复上述提取步骤2次，合并上清液，定容到65 mL，用于TVB-N的测定。

1.3.4 游离氨基酸含量测定

采用氨基酸全自动分析仪进行测定。上述1.3.2中测完pH值的上清液，取适量，加10%三氯乙酸按1∶1稀释，放置30 min后，离心取上清，过孔径0.22 μm滤膜后供上机测定使用。

1.3.5 生物胺的检测

用0.1 mol/LHCl溶解标准品，配成质量浓度为2 mg/mL的标准储备液，稀释为适当浓度，保存于棕色瓶中，4℃储藏备用。

取待测样品2.0 g，加10 mL（0.4 mol/L）高氯酸，10 000 r/min匀浆30 s，3 000 r/min离心10 min，取上清液。沉淀中再次加入10 mL（0.4 mol/L）高氯酸溶液，充分混匀，重复提取1次，合并2次上清液，用高氯酸（0.4 mol/L）溶液定容到25 mL，即为生物胺提取液，用于衍生化。

取标准溶液或提取液1 mL进行柱前衍生化处理。加入100 μL氢氧化钠 （2 mol/L）溶液，300 μL饱和NaHCO3溶液和2 mL丹酰氯（丙酮溶解，10 mg/mL）溶液，于40℃反应 45 min；反应完毕，取出加入100 μL浓氨水，静置30 min，加入乙腈定容至5 mL，振荡混匀，取适量的溶液用孔径0.22 μm滤膜过滤，采用高效液相色谱（HPLC）法进行生物胺测定。

HPLC检测条件：Xtimate C18色谱柱(美国Welch公司)，检测波长为254 nm，进样量20 μL，柱温30℃，流动相A为水，B为乙腈，梯度洗脱程序如表1所示。

表1 HPLC检测流动相梯度洗脱程序

1.4 数据分析

本试验数据为3次重复的平均值。采用SPSS13.0软件进行数据统计和方差显著性分析。

2 结果与分析

2.1 不同储藏过程中pH值、TVB-N值的变化

不同条件储藏过程中蟹肉pH值和TVB-N值的测定结果见表2。由表2可以看出，河蟹肌肉pH值初始值为8.04，在储藏前9 d内pH值变化不大，12 d时pH值急剧下降，这可能是因为前9 d河蟹处于鲜活状态，12 d时河蟹已死亡，研究发现当动物呼吸停止时，血液停止循环引起供氧停止，组织呼吸转变成无氧糖酵解途径，体内糖原开始分解并产生乳酸，使肌肉的pH值下降。在冷冻储藏过程中pH值呈下降趋势，且前6周下降比较缓慢，12周下降比较快。与室温贮藏相比，冷冻贮藏可以较长时间内维持河蟹肌肉的pH值。

挥发性盐基氮含量（TVB-N值）可反映出蛋白质分解程度和腐败程度。欧盟委员会法规及国内外多项研究建议水产品的TVB-N值可被消费者接受的最高浓度范围为25 mg/100g～35 mg/100g。不同的水产品对于TVB-N值的要求不同，根据GB 2733—2005对鲜、冻动物性水产品卫生要求的规定，不同水产品中TVB-N含量范围为：海蟹≤25 mg/100g，海水贝类≤15 mg/100g，海水鱼、虾、头足类≤30 mg/100g，淡水鱼、虾≤20 mg/100g，煌鱼、牡蛎≤10 mg/100g。

由表2可知，处于鲜活状态的河蟹TVB-N值变化不大，12 d后急剧上升，说明死亡的河蟹肌肉蛋白质发生分解造成肌肉的腐败劣变。冷冻储藏过程中，河蟹TVB-N值呈上升趋势，但贮藏18周后TVB-N值仍低于20 mg/100g，说明冻藏储存可以维持较低的TVB-N值，使河蟹保持较好的新鲜度。

表2 不同储藏过程中蟹肉pH值和TVB-N值的变化

2.2 不同储藏过程中游离氨基酸含量的变化

不同条件储存过程中蟹肉游离氨基酸含量的测定结果见下页表3。由表3可知，共检出河蟹肌肉中游离氨基酸为19种，新鲜样品中总氨基酸含量为19.361 mg/g，甘氨酸、丙氨酸、精氨酸和脯氨酸含量比较高，是蟹肉的主要呈味氨基酸。室温下贮藏，蟹肉中总氨基酸含量在前9 d内没有明显的变化趋势，12 d后下降到 10.194 mg/g，下降了47.4%，呈味氨基酸也明显减少。冻藏过程中，蟹肉中总氨基酸随时间的延长呈下降趋势，下降速度比较缓慢，18周后下降了34%。贮藏过程中氨基酸成分和含量的变化可能是因为蟹肉蛋白质发生分解，结果表明冻藏可以有效延缓蛋白质的分解。

2.3 不同储藏过程中生物胺含量的变化

生物胺（Biogenic Amine，BA）是一类具有生物活性的低分子质量含氮有机化合物的总称，广泛存在于生物体及多种食品当中。生物胺是生物体内的正常活性成分，在动植物和微生物活性细胞中发挥重要的生理作用。研究发现，适度的生物胺含量有益于健康，如儿茶胺、组胺等可以调节神经活动，控制血压，但若摄入过量的生物胺，则会导致食物中毒。组胺被认为是最具有毒性的生物胺，被人们广泛关注。有研究报道，尸胺、腐胺、酪胺、组胺为有毒生物胺，如尸胺、腐胺的半数致死量分别是270 mg/kg、1750 mg/kg；组胺口服8 mg～40 mg就可引起轻微的中毒，而超过100 mg会引起严重的中毒；酪胺口服超过100 mg时会引起偏头疼，苯乙胺口服超过3 mg时会引起偏头疼。

表3 不同储藏过程中蟹肉游离氨基酸含量的变化

不同条件储藏过程中蟹肉生物胺含量的测定结果见表4。表4结果显示，新鲜的蟹肉中共检测到3种生物胺，分别为腐胺、亚精胺和精胺，总生物胺含量为28.78 mg/kg。室温下贮藏，前9 d蟹肉中总生物胺含量没有明显变化，6 d后有微量组胺生成，可能是组氨酸的分解作用，12 d后腐胺急剧增长，并有尸胺、大量组胺和酪胺的生成，总生物含量达到1 981.03 mg/kg。冻藏的河蟹随着时间延长，总生物胺含量逐渐增加，12周有少量尸胺生成，18周后有少量酪胺生成，说明低温贮藏可有效抑制螃蟹肌肉总生物胺含量以及腐胺、尸胺、酪胺的产生，延长货架期。夏文水等人在河蟹死亡后新鲜度变化的研究中发现，死后的河蟹生物胺含量会迅速积累，而且组胺速度生成最快，河蟹死后在20℃条件下贮藏，3 h后组胺含量达到63.34 mg/kg，12 h后达到73.97 mg/kg，而在4℃条件下贮藏，24 h、72 h后组胺含量分别达到45.48 mg/kg和91.21 mg/kg。这说明河蟹死亡后生物胺含量上升速度很快，食用死蟹会出现食物中毒现象。

表4 蟹肉不同储藏过程中的生物胺含量的变化

3 结论

本试验研究了河蟹自然死亡组和冷冻储藏组贮藏过程中蟹肉品质的变化，试验结果表明，河蟹未死亡前pH值和TVB-N值无明显变化，自然死亡后室温条件下储藏过程中河蟹的pH值、TVB-N值急剧上升，总氨基酸含量下降，总生物胺含量增加，达到1 981.03 mg/kg，且有尸胺、组胺和酪胺的生成。冷冻储藏的河蟹其pH值和TVB-N值的变化显著延缓，总氨基酸含量下降缓慢，生物胺含量有所增加，18周后仅达到41.20 mg/kg，说明冻藏可以有效延缓各指标的变化，延长货架期，保证食用安全性。

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