中药复方清化饮对慢性萎缩性胃炎大鼠血清IL-10、NO、GAS及血浆MTL的影响

黄铭涵，王文荣，黄 健，钟国栋，许赋瑜，李思汉，林建龙，王 鑫，林秀明，黄恒青，林 平(. 福建中医药大学附属第二人民医院，福建福州 5000；. 福建医科大学教学医院福建省妇幼保健院，福建福州 5000；. 福建中医药大学，福建福州 5008)

中药复方清化饮对慢性萎缩性胃炎大鼠血清IL-10、NO、GAS及血浆MTL的影响

黄铭涵1，王文荣1，黄 健2，钟国栋1，许赋瑜3，李思汉3，林建龙1，王 鑫1，林秀明1，黄恒青1，林 平1
(1. 福建中医药大学附属第二人民医院，福建福州 350003；2. 福建医科大学教学医院福建省妇幼保健院，福建福州 350001；3. 福建中医药大学，福建福州 350108)

目的探讨中药复方清化饮对大鼠慢性萎缩性胃炎(CAG)胃黏膜病理与血清白细胞介素-10(IL-10)、一氧化氮(NO)、胃泌素(GAS)及血浆胃动素(MTL)的影响。方法将53只Wistar大鼠随机分为空白组8只和CAG造模组45只，予建立病证结合CAG大鼠模型。抽检大鼠确认造模成功后，将CAG造模组余下40只大鼠随机分为模型组、维酶素组、中药低、中、高剂量组各8只。予相应药物干预30 d后处死大鼠，腹主动脉取血并留取胃组织，分析各组大鼠胃黏膜病理与血清IL-10、NO、GAS及血浆MTL浓度。结果与空白组比较，模型组大鼠见不同程度的胃黏膜萎缩，血清IL-10、GAS浓度降低，血清NO、血浆MTL含量升高(P<0.01)。与模型组比较，清化饮可不同程度改善胃黏膜病理情况，升高血清IL-10、GAS浓度，降低血清NO、血浆MTL含量(P<0.05或P<0.01)，且高剂量组疗效更为显著(P<0.01)。结论中药复方清化饮可调控血清IL-10、NO、GAS及血浆MTL的表达失衡，有效逆转CAG大鼠胃黏膜病变。

清化饮；慢性萎缩性胃炎；胃黏膜病理；血清白细胞介素-10(IL-10)；血清一氧化氮(NO)；血清胃泌素(GAS)；血浆胃动素(MTL)；大鼠

慢性萎缩性胃炎(chronic atrophic gastritis, CAG)是临床常见难治性胃病，因与胃癌关系密切，已被列为胃癌的癌前疾病[1]。CAG结合临床特征，属中医学“胃脘痛、胃痞”等疾病范畴。CAG在普通人群中，发病率随着年龄增长而有所升高的趋势，据统计电子胃镜、胃黏膜病理检出率达7.5%～13.8%[2]。中药复方清化饮为我科治疗CAG的院内制剂，我们之前的临床研究证实其能有效逆转CAG患者的胃黏膜萎缩，并显著改善胃脘胀痛、痞满等症状[3]。本研究旨在观察清化饮对脾虚湿热证CAG大鼠胃黏膜组织学、血清白细胞介素-10(interleukin-10, IL-10)、一氧化氮(nitric oxide, NO)、胃泌素(gasmn, GAS)、血浆胃动素(motilin, MTL)的影响，探讨其疗效及可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1药物清化饮(闽药制字Z05104030)由福建中医药大学附属第二人民医院药剂室提供。药物组成：白扁豆220 g、茯苓220 g、薏苡仁220 g、茵陈110 g、佩兰66 g、白豆蔻33 g、黄连33 g、厚朴66 g、赤芍110 g，煎液滤过浓缩至含生药材2.2 g/mL，并灭菌瓶装。维酶素片(北海阳光药业有限公司，国药准字H45021183，批号：20140311)。

1.2主要试剂与仪器大鼠IL-10、NO、GAS、MTL ELISA试剂盒(上海缘叶生物科技有限公司)。Wellwash 4 MK2洗板机(Thermo Fisher)；移液枪(Thermo Labsystems)；XW-80A漩涡混合器(上海青浦沪西仪器厂)；连续分液器(TOMOS LIFE SCIENCE Group)；高通量组织研磨器(宁波新芝生物科技股份有限公司)。

1.3动物分组与病证结合CAG模型建立雄性SPF级Wistar大鼠53只，4周龄，购自上海斯莱克实验动物有限公司[合格证号：SCXK(沪)：0164377，2012-0002]，每笼3～5只。所有大鼠均在恒温、恒湿条件下饲养，自由饮食、饮水，采用人工照明，每天昼夜各12 h交替。于实验前适应喂养1 周后，按随机数字表法分成空白组8只，CAG造模组45只。造模方法参照文献[4]方法并加以改进，造模组大鼠前12周在正常饲养环境中，以0.5 g/L氨水作为饮用水自由饮用，20 mmol/L去氧胆酸钠溶液灌胃2 mL/次，每日1次，600 mL/L乙醇空腹灌胃2 mL/次，每周2次。空白组大鼠正常饮食、饮水。经上述造模干预，造模组大鼠逐渐出现被毛松散蓬乱，毛色偏黄无光泽，眼眯无神，活动少而迟钝，拱背、喜扎堆，形体瘦小，食量下降。12周末，随机处死造模组3只大鼠，行胃组织病理检查，判断是否造模成功。CAG造模成功后模型组大鼠饲以高脂高糖饮食，即200 mL/L蜂蜜水自由饮用，隔日灌服油脂1 g/(100 g大鼠体质量·d)；14 d 后放入人工气候箱中，温度为(32±2)℃，相对湿度为95%，每天12 h/d×5 d。经上述造模干预，造模组大鼠逐渐出现小便量多色黄，大便便溏或黏稠发暗，垫料馊臭明显，造成脾虚湿热证CAG大鼠模型。造模结束后，剔除死亡及随机处死的大鼠5只，将余下造模成功的40只大鼠，按随机数字表法分为模型组、维酶素组、中药低、中、高剂量组，每组8只。

1.4药物干预方法根据药物剂量等效换算，中药低剂量、中剂量、高剂量组分别按照3.3 g/(kg·d)、6.6 g/(kg·d)、13.2 g/(kg·d)的清化饮原液剂量灌胃1次；根据大鼠体重将药液用生理盐水稀释至每次4 mL/只。维酶素组予维酶素300 mg/(kg·d)灌胃每次4 mL/只。空白对照组及CAG模型对照组给予每次4 mL/只生理盐水灌胃。灌胃共30 d。

1.5标本采集药物干预结束后，禁食24 h，腹腔注射100 g/L水合氯醛(3.0 mL/kg)，麻醉成功后沿腹部正中线剖开腹腔，腹主动脉取血5 mL，平均分置于EDTA 抗凝试管及普通试管中。处死后取胃后沿胃大弯剪开，以生理盐水清洗干净胃黏膜表面，肉眼观察胃黏膜结构形态、色泽。于胃窦部剪取黄豆大组织2块，立即放入液氮中冻存。余下的胃窦部组织迅速置于40 g/L多聚甲醛溶液中。

1.5.1HE染色评价病理组织学改变 40 g/L多聚甲醛固定24 h，常规石蜡包埋，连续切片5张，片厚4 μm，HE染色，光学显微镜下观察了解胃黏膜病理组织学改变。

1.5.2IL-10、NO、GAS、MTL含量检测 血标本常温静置2 h后离心，3 000 r/min，15 min，采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清IL- 10、NO、GAS及血浆MTL水平。

2 结 果

2.1大鼠造模及干预期间的死亡情况造模组大鼠造模后期死亡2只，模型组大鼠治疗期间死亡1只。空白组及维酶素组、中药干预组大鼠实验期间均全部存活。

2.2干预后6组大鼠胃组织病理变化的比较空白组大鼠胃黏膜厚度正常，腺体形态规则，细胞呈单层柱状，胞质透明或呈小空泡状，腺上皮与腺管分界清楚，固有腺及黏膜层毛细血管无扩张，黏膜肌层较薄，未见增生及向黏膜层伸入。模型组大鼠见胃黏膜不同程度的萎缩，固有层腺体减少，排列不规则，间隙较大，镜下可见肠上皮化生、异型增生病理改变。与模型组相比，中药各剂量组及维酶素组病理均有不同程度的改善，以中药高剂量组改善为优，镜下见胃黏膜腺体数量增多，排列较模型组整齐，固有层单个核细胞数量少(图1)。

图1大鼠胃黏膜的组织病理学变化

Fig.1 Pathological images of rat gastric mucosal tissue (×200)

A：空白组；B：模型组；C：维酶素组；D：中药低剂量组；E：中药中剂量组；F：中药高剂量组。

2.36组大鼠血清IL-10、NO变化的比较ELISA测定结果显示，与空白组比较，造模后模型组血清中IL-10质量浓度明显降低(P<0.01)，NO含量明显升高(P<0.01)。同模型组比较，中药低、中、高剂量组及维酶素组血清中IL-10质量浓度均升高，NO含量均降低(P<0.05或P<0.01)，以中药高剂量组疗效更为明显(P<0.01)，且中药高剂量组对血清IL-10升高优于维酶素组(P<0.05，表1)。

2.46组大鼠血清GAS、血浆MTL变化的比较ELISA测定结果显示，与空白组比较，造模后模型组血清中GAS质量浓度明显降低(P<0.01)，血浆MTL质量浓度明显升高(P<0.01)。同模型组比较，中药低、中、高剂量组及维酶素组血清中GAS含量均升高，血浆MTL含量均降低(P<0.05或P<0.01)，以中药高剂量组疗效更为明显(P<0.01)，且中药高剂量组对血浆MTL降低优于维酶素组(P<0.05，表2)。

表16组大鼠血清IL-10、NO变化的比较

Tab.1 Comparison of variations of serum IL-10 and NO in all the groups

组别例数IL⁃10(pg/mL)NO(μmol/L)空白组837．32±4．1515．72±2．16模型组725．46±2．82∗∗27．58±4．33∗∗维酶素组830．45±4．21△20．69±3．12△△中药低剂量组830．24±4．28△22．05±4．07△中药中剂量组831．57±3．78△△21．54±3．90△中药高剂量组834．45±3．15△△◇18．52±2．43△△

与空白组比较，**P<0.01；与模型组比较，△P<0.05，△△P<0.01；与维酶素组比较，◇P<0.05。

表26组大鼠血清GAS、血浆MTL变化的比较

Tab.2 Comparison of variations of serum GAS and plasma MTL in all the groups (pg/mL)

与空白组比较，**P<0.01；与模型组比较，△P<0.05，△△P<0.01；与维酶素组比较，◇P<0.05。

3 讨 论

CAG是一种病理学上以胃黏膜固有腺体数目减少，腺体萎缩，胃黏膜变薄、黏膜肌层增厚等为主要特征的慢性消化系统疾病，常伴有肠上皮化生及异型增生，临床表现为上腹部隐痛、胀满、嗳气，食欲不振等[1]。目前，西医对CAG的治疗，除促胃动力药、胃黏膜保护剂外，重点报道的包括H.pylori的根治治疗。有证据表明根治H.pylori感染可减少胃黏膜萎缩和肠化的发生，但对能否逆转胃黏膜萎缩和肠化，仍然存在比较多的争议[5-6]。中医药以其辨证论治、综合治疗、标本兼治的用药特点，在临床中收到治愈率较高、复发率较低的良好效果。除“脾虚”外，广大学者对CAG的病因病机进行了积极探索。李佃贵[7]认为“浊、毒”是CAG的重要致病因素。牛兴东[8]认为CAG病机不外乎“虚”、“郁”、“瘀”、“毒”四端，治疗以调气活血解毒法为主要治疗大法。劳绍贤[9]结合地域特点，认为脾胃湿热证是脾胃病证的一大特点。姚乃礼[10]认为邪毒伤胃、胃络瘀阻为CAG基本病机，邪毒犯胃，气机郁结于胃络，或病久伤正，脾胃之气滞塞，气血运行不畅，而致胃络瘀阻，胃膜失其濡养而致损伤。我们近年来应用中医证素调查，结果显示CAG证素特点除脾气虚弱外，实证证素单元包括湿、热、瘀等[11-12]。

我科是国家中医药管理局慢性胃炎诊疗协作组副组长单位，在慢性胃炎研究方面获得多项成果。中药复方清化饮已被国家中医药管理局十一五脾胃重点专科采纳，作为“慢性萎缩性胃炎”协定处方应用并推广。方中由白扁豆、茯苓、薏苡仁、茵陈、佩兰、白豆蔻、黄连、厚朴、赤芍组成，具有健脾清化、醒脾舒络之功。方中以白扁豆、茯苓、薏苡仁益气健脾、利湿渗湿，茵陈、黄连清中焦壅滞之湿热，佩兰、白豆蔻芳香悦脾、化浊燥湿，厚朴化湿消胀，赤芍祛胃络之瘀邪。之前研究证实，清化饮对CAG患者临床症状及病理组织学改善有显著疗效[3]。

本研究提示，与空白组比较，CAG模型组大鼠血清IL-10浓度明显降低，血清NO含量升高，提示在CAG发病的进程中伴IL-10活性降低和NO过量生成。IL-10作为典型的多效性抗炎与免疫抑制性细胞因子，其生物活性广泛，早期曾被命名为细胞因子合成抑制因子(CSIF)，主要由活化的辅助性T细胞亚群TH2、单核细胞、巨噬细胞、B细胞产生，其生物学作用是抑制炎症反应和IL-6、IL-1β、TNF-α等促炎性细胞因子的释放，调节B细胞、T细胞等多种免疫细胞的增殖和活化，抑制一氧化氮合酶(NOS)和环氧合酶2(COX-2)的表达[13]。NO是一种兼具神经递质作用和细胞内、细胞间信使的信息分子，由NOS催化L-精氨酸所产生，在体内参与诸多的病理生理过程[14]。NOS包括原生型(cNOS)和诱生型(iNOS)两种异构体，其中iNOS在组织中广泛分布，iNOS活性增强可激活释放大量NO，过量生成的NO可再生成细胞毒性更强的过氧化亚硝酸盐，直接损害胃黏膜血管内皮细胞，加重黏膜组织损伤，并刺激释放更多NO，形成恶性循环，加重CAG胃黏膜的炎性反应[15]。

GAS是研究最早、最多的一种胃肠激素，是胃窦和十二指肠近端黏膜细胞的重要胃肠激素。其主要生理作用之一是能促进胃酸分泌，且还可以促使胃窦的收缩和下食管括约肌的收缩，进而刺激胆囊、胃及胰腺分泌。当胃黏膜发生萎缩等病理改变时，细胞数目会随之减少，进而会引起分泌量随之减少[16]。有研究发现GAS分泌量的多少能映射胃黏膜的萎缩等情况，可作为诊断更灵敏的指标[17]。本研究证实胃黏膜萎缩可伴血清GAS分泌量的明显减少(P<0.01)，并可见血清MTL分泌增多(P<0.01)。MTL是一种多肽激素，由胃窦G细胞产生，通过直接作用胃壁细胞上的胃泌素受体，或通过刺激产生Reg蛋白等生长因子参与消化间期胃肠活动，可诱发胃强烈收缩和小肠明显的分节运动，与胃肠功能障碍疾病发病机制有关[18]。本研究中观察到模型组大鼠血浆MTL水平上升，其可能机制为CAG大鼠胃腺体萎缩、胃组织中的MTL受体减少，反馈性引起MTL的增加，从加使血浆MTL水平上升。也有学者认为胃黏膜存在的炎症刺激迷走神经，产生前列腺素E2以及其他炎症介质和血管活性因子，从而导致血浆MTL的分泌增加[19]。

本研究观察到，经清化饮干预后，CAG大鼠血清IL-10、GAS浓度升高，血清NO、血浆MTL含量降低，HE染色切片见胃黏膜组织病理有效改善，以高剂量组最为明显，证实清化饮可通过调控IL-10、GAS、NO和MTL表达失衡，改善CAG大鼠的胃黏膜萎缩病理。本研究为进一步探讨清化饮通过调控炎性、增殖信号通路逆转CAG提供了思路。

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InfluencesofChineseherbalcompoundQinghuayinonserumIL-10,NO,GASandplasmaMTLinanimalmodelofchronicatrophicgastritisinrats

HUANG Ming-han1, WANG Wen-rong1, HUANG Jian2, ZHONG Guo-dong1, XU Fu-yu3, LI Si-han3, LIN Jian-long1, WANG Xin1, LIN Xiu-ming1, HUANG Heng-qing1, LIN Ping1
(1. the Second People’s Hospital Affiliated to Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350003; 2. Fujian Medical University Teaching Hospital;Fujian Maternity and Child Health Hospital, Fuzhou 350001; 3. Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350108, China)

ObjectiveTo explore the effects of Chinese herbal compound Qinghuayin on the pathological changes of gastric mucosa and interleukin-10 (IL-10), nitric oxide (NO), gasmn (GAS) and motilin (MTL) in the serum in the animal model of chronic atrophic gastritis (CAG) in rats.MethodsWe divided 53 Wistar rats randomly into blank control group (n=8) and CAG model group (n=45), and the animal model of CAG in rats was replicated by combination of disease and syndrome. After confirming the sampled rat model was successful built, the other 40 CAG rats in CAG model group were divided into model group, vitacoenzyme tablet group, low-dosage TMC group, medium-dosage TMC group, and high-dosage TMC group (each groupn=8). With the corresponding drug intervention to different rats for 30 days, the rats were executed. Then their blood was drawn from the abdominal aorta and the gastric tissue was taken to analyze the changes of serum IL-10, NO, GAS and MTL concentrations and gastric mucosa pathology.ResultsCompared with blank control group, model group had various degrees of gastric mucosa atrophy; decreased concentrations of serum IL-10 and GAS; increased NO and MTL (P<0.01). Compared with model group, Qinghuayin could improve gastric mucosa pathology in different degrees and increase the concentrations of IL-10 and GAS, decrease the concentrations of NO and MTL (P<0.05 orP<0.01). What’s more, the curative effect in high-dosage TMC group was better (P<0.01).ConclusionChinese herbal compound Qinghuayin can effectively regulate the lopsided expressions of serum IL-10, NO, GAS and MTL and reverse the pathological and histological changes in the gastric mucosa of CAG rats.

Qinghuayin; chronic atrophic gastritis (CAG); pathology of gastric mucosa; serum interleukin-10 (IL-10); serum nitric oxide (NO); serum gasmn; plasma motilin (MTL); rat

2016-11-22

2017-05-04

福建省科技厅重点项目(No.2015Y0023)；福建省自然科学基金项目(No.2015J01403，2017J01305)；福建省中青年教师教育科研项目(No.JA15247)；福建省中医药科研项目(No.2017FJZYJC206)

Supported by the Key Project of Fujian Provincial Science and Technology Department (No.2015Y0023), the Natural Science Foundation of Fujian Province (No.2015J01403 and 2017J01305), Fujian Provincial Young and Middle-aged Teacher Education Research Project (No.JA15247), and Fujian Traditional Chinese Medicine Research Project (No.2017FJZYJC206)

林平. E-mail: plane97@163.com

优先出版：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20171205.1552.022.html(2017-12-05)

R285.5

A

10.7652/jdyxb201801025

(编辑 韩维栋)