20AA复方氨基酸联用大剂量维生素B6对密闭舱室烟雾吸入性肺损伤救治效果研究

孙磊 蔡颖 敖琳 刘晋祎 陶成玉 岳茂兴 曹佳

·论著·

20AA复方氨基酸联用大剂量维生素B6对密闭舱室烟雾吸入性肺损伤救治效果研究

孙磊1蔡颖1敖琳1刘晋祎1陶成玉2岳茂兴3曹佳1

目的探讨20AA复方氨基酸注射液(丰诺安)联用大剂量维生素B6新疗法对密闭舱室烟雾吸入性肺损伤的救治效果。方法将48只清洁级雄性SD大鼠完全随机分为正常对照组、损伤对照组及救治组，每组16只，分别为：正常对照组自由呼吸新鲜空气，腹腔注射70 mL/kg 0.9%氯化钠注射液，连续3 d；损伤对照组以只鼻染毒的方式吸入烟雾10 min后，腹腔注射70 mL/kg 0.9%氯化钠注射液，连续3 d；治疗组以口鼻染毒的方式吸入烟雾10 min后，腹腔注射50 mL/kg丰诺安注射液及50 mg/mL维生素B61g/kg，连续3 d。观察死亡率，进行大鼠肺功能检测、肺大体病理观察及肺水含量测定。结果烟雾吸入后动物表现出明显的呼吸困难及精神神经症状。与损伤对照组比较，治疗组大鼠死亡率增加(60% vs 40%)，两组大鼠生存时间差异无统计学意义(χ2=0.684,P>0.05)。烟雾染毒后大鼠肺大体表现为明显的肺水肿和弥漫性出血，救治组肺出血及水肿程度轻于损伤对照组；损伤对照组大鼠肺干湿比显著高于正常对照组[(5.02±0.13) vs (4.71±0.13),P<0.01]，治疗组大鼠肺干湿比显著低于损伤对照组[(4.76±0.18) vs (5.02±0.13),P<0.05]；损伤组大鼠肺功能PAU显著高于正常对照组[(1.93±0.58) vs (1.33±0.17),P<0.05]，治疗组大鼠PAU、EF50显著低于损伤对照组[(1.29±0.43) vs (1.93±0.58),P<0.05;(0.58±0.15) mL/sec vs (1.19±0.40) mL/sec,P<0.05]。结论丰诺安联用大剂量维生素B6能够明显缓解烟雾吸入导致肺损伤，改善肺功能，但大鼠可能由于不能耐受腹腔注射临床剂量的联用药物，从而导致死亡率增加。

密闭舱室； 烟雾吸入； 急性肺损伤； 复方氨基酸注射液(20AA)； 维生素B6

火灾中85%以上的死亡者是由烟雾吸入引起的[1]。坦克舱室内使用了大量的非金属材料,在战斗中一旦中弹起火,会产生大量的有毒有害烟雾,烟雾吸入后以急性肺损伤为主要损害特征[2-3]。目前的烟雾模拟染毒实验研究虽然已经筛选出多种救治药物，能够明显缓解动物烟雾吸入导致的急性肺损伤[4-6],但是在临床治疗实践中其疗效尚不明确。丰诺安联合大剂量维生素B6是目前在临床上用于救治急重症患者的一种新的疗法,该疗法经大量临床病例证实对化学性肺水肿、肝衰竭及重度凝血功能障碍等重症具有显著的疗效[7-9]。笔者在前期的研究基础上,进一步探讨丰诺安联合大剂量维生素B6新疗法对坦克舱室烟雾吸入性肺损伤的救治效果,为深入开展机制研究奠定基础。

资料与方法

一、实验动物与材料

1.实验动物:健康清洁级雄性SD大鼠48只,7～9周龄,体重200～250 g,由第三军医大学第三附属医院实验动物中心提供[动物使用合格证号:SCXK(渝)20131018],常规饲养于第三军医大学军事预防医学院毒理学研究所动物房。将48只SD大鼠普通基础饲料适应性喂养1周后,按随机数字表法分为3组,每组16只,进行随机对照实验。

2.主要试剂:维生素B6注射液:0.1 g/支(2 mL),石药集团欧意药业有限公司。复方氨基酸注射液(20AA):丰诺安注射液,50 g总氨基酸(500 mL),辰欣药业股份有限公司。复方氯化钠注射液:0.9%等渗盐水,四川科伦药业股份有限公司。

3.主要实验仪器:HOPE-MED 8504型密闭舱室烟雾模拟染毒实验系统(天津合普公司)，120A型电子分析天平(瑞士Drecisa公司)，WBP小动物肺功能仪(美国BUXCO公司)，LS-O410恒温烤箱(美国Fisher Scientific公司)。

二、实验动物建模和治疗方法

根据参考文献[2],将动物置于口鼻染毒箱内,口鼻染毒箱放置在密闭舱室烟雾模拟染毒实验系统中,动物适应10 min。将裁剪好的舱室条状非金属材料36 g铺设在石英加热管内,调节发烟温度至500℃、燃烧步进速度为1.0 cm/min、进氧流量为0.5 m3/h、染毒舱气压为-60 Pa。待口鼻染毒箱内的烟雾分布均匀后,动物开始染毒并计时,连续染毒10 min。染毒结束后将动物取出放回饲养笼中,置于开放环境中呼吸新鲜空气,自由饮食和饮水。动物分组与治疗方法如下:

正常对照组：在实验过程中自由呼吸新鲜空气,每日腹腔注射70 mL/kg的0.9%氯化钠注射液(于每天9∶00、14∶00、19∶00平均分3次完成注射),连续3 d;损伤对照组以口鼻染毒方式吸入烟雾10 min后,从染毒当日开始每天腹腔注射70 mL/kg 0.9%氯化钠注射液(于每天9∶00、14∶00、19∶00平均分3次完成注射),连续3 d;治疗组以口鼻染毒的方式吸入烟雾10 min后,从染毒当日开始每天腹腔注射50 mL/kg丰诺安注射液及50 mg/mL的维生素B6(1 g/kg,于每天9∶00、14∶00、19∶00平均分3次完成注射),连续3 d。

三、观察指标

1.死亡率及生存时间测定:从每组中随机选择10只动物,观察染毒后3 d内各组动物的中毒反应、死亡情况及生存时间。

2.肺功能测定:在染毒后第4天,将每组剩余6只大鼠分别置于WBP小动物肺功能仪(美国BUXCO公司)中,检测如下指标:呼吸频率(f)、潮气量(TVb)、每分钟通气量(MVb)、呼吸间歇(PAU)、增强型呼吸间歇(Penh)、呼吸中期流速(EF50)。

3.肺大体病理观察:肺功能测定结束后,将大鼠常规麻醉后股动脉放血处死,立刻分离肺脏组织,肉眼观察肺脏出血及水肿情况。

4.肺水含量测定:取各组大鼠右肺中叶,吸水纸吸干表面水分及血液,称重。然后置于80℃烤箱,72 h后称量肺干重,计算肺干湿比(wet and dry weight ration,W/D)[10]。

四、统计学分析

结 果

一、动物中毒情况

烟雾吸入过程中,动物立刻出现呼吸节律加快,动物表现为挣扎和烦躁,部分动物尾部僵直。染毒结束后部分动物死亡,存活动物均出现较严重呼吸困难,肺部可闻及水泡音。动物伏地不动,尾部僵直,部分昏迷或休克,甚至抽搐,四肢湿冷,口唇紫绀,感觉和运动障碍。眼球颜色变为淡红色,眼睛红肿、流泪、畏光。烟雾吸入24 h后,大部分动物上述症状基本消失,可自由活动、进食和饮水。

二、动物死亡率及生存时间

染毒10 min后,3 d观察时间内,损伤对照组动物死亡率为40%,治疗组动物死亡率为60%,正常对照组动物无死亡(图1)。三组间动物生存时间差异有统计学意义(χ2=6.320,P<0.05),其中损伤组和治疗组与对照组比较生存时间显著降低(χ2=4.750,P<0.05;χ2=6.401,P<0.05),治疗

组与损伤对照组比较动物生存时间差异无统计学意义(χ2=0.684,P>0.05)。见图2。

图1 各组大鼠死亡率

图2 各组大鼠生存曲线图

三、肺大体病理观察

正常对照组大鼠肺大体形态正常,肺表面无明显的出血和水肿;烟雾染毒后大鼠肺大体病理改变主要表现为肺水肿和弥漫性出血。其中救治组的肺出血及水肿程度轻于损伤对照组。见图3。

四、肺水含量测定

三组间动物肺湿干比有显著差异(F=7.383,P<0.001)。其中,损伤对照组动物肺干湿比与正常对照组显著增加(P<0.001),治疗组肺干湿比与正常对照组比较差异无统计学意义(P>0.05);与损伤对照组比较,治疗组肺干湿比显著降低(P<0.05)。见表1。

五、肺功能测定

治疗组呼吸频率显著低于正常对照组和损伤对照组(P<0.01),治疗组MVb显著低于正常对照组和损伤对照组(P<0.05);损伤对照组Penh显著高于正常对照组(P<0.01);损伤对照组PAU显著高于正常对照组(P<0.05),治疗组PAU显著低于损伤对照组(P<0.05);治疗组EF50显著低于损伤对照组(P<0.05)。见表2。

注：a为对照组;b为损伤对照组;c为治疗组

图3 各组大鼠肺大体病理改变表1 各组大鼠肺水含量变化

注：P0为三组间比较的P值,P1为损伤对照组与正常对照组比较的P值，P2为治疗组与正常对照组比较的P值，P3为治疗组与损伤对照组比较的P值。W/D为肺干湿比

讨 论

吸入性损伤是目前火灾烧伤病人死亡最常见的原因。统计结果表明,火灾中85%以上的死亡者是由于烟雾的影响,其中大部分是吸入烟尘及有毒气体昏迷后而致死的[1]。颗粒物、有毒气体及缺氧环境共同作用,往往使肺部损伤急剧恶化,给伤员的救治带来极大的困难。近年来,随着对急性烟雾吸入性肺损伤病理生理学研究的发展,人们提出了一系列的特异性的综合救治措施,这些措施虽然大多在实验室动物研究方面取得了明显的疗效[4-6],但是在烟雾吸入病人的临床救治中其疗效却未能被证实。

近年来,20AA高支链复合氨基酸丰诺安联用大剂量维生素B6新疗法被广泛应用于临床危重病症的救治[7-9]。大量的临床病例证实,新疗法对于重度化学性肺水肿、重症肝功能障碍、肝性脑病及严重凝血功能障碍灯危重病症均有明确的疗效。但其机制目前还不清楚。人体正常生命代谢活动的二大循环是三羧酸循环及鸟氨酸循环,当机体受到严重创伤或大手术打击下,人体正常的二大循环功能将受到影响。而丰诺安(20AA高支链肝病复方氨基酸) 由20种氨基酸配制而成,主要用来预防和治疗肝性脑病、肝病或肝性脑病急性期的静脉营养,并提供了机体代谢的底物。它不仅能纠正支链氨基酸和芳香氨基酸代谢的失衡[11],还能抑制大脑中假性神经递质的形成,并能改善肝性脑病。丰诺安中的L-鸟氨酸能够迅速穿透线粒体膜,在线粒体内通过代谢,携带一分子二氧化碳和一分子氨,转变为L-瓜氨酸,并又迅速穿过线粒体,配合L-天冬氨酸,即能迅速激活肝细胞内的尿素循环,将机体在受到严重创伤或大手术打击下产生的有害的二氧化碳及氨通过鸟氨酸代谢(尿素循环)排出体外,从而使得肝内酶代谢逐步恢复,凝血因子又得以产生,迅速恢复内源性凝血途径,同时还提供了机体代谢的底物[12]。大剂量维生素B6是人体各种氨基酸、神经递质γ-氨基丁酸(GABA) 和谷氨酸(Glu)的辅酶,现已知肝脏有60多种酶需要维生素B6参与,配合维生素C,能够清除MODS产生的有害自由基,能迅速降低自由氧基对脏器的毒害。能促进酶代谢的恢复。大剂量维生素B6还是天然的利尿剂,维生素B6在体内半衰期短,很快排出体外,有1例患者连续静脉输入维生素B6在5 636支,另外在岳茂兴等[8]临床应用的20 000多例患者中,没有1例发生过量事件。

表2 各组大鼠肺功能指标改变情况

注：P0为三组间比较的P值,P1为损伤对照组与正常对照组比较的P值;P2为治疗组与正常对照组比较的P值;P3为治疗组与损伤对照组比较的P值;f为呼吸频率，TVb为潮气量，MVb为每分钟通气量，Penh为增强型呼吸间歇，PAU为呼吸间歇，EF50为呼吸中期流速

本研究将临床上已被证实对多种重症疾病有明确疗效的新疗法用于烟雾吸入性肺损伤的救治研究,初步观察其救治效果。结果显示,给予实验大鼠临床剂量的丰诺安及维生素B6,动物的肺大体病理改变明显减轻,表现为肺水肿及肺出血减少。同时治疗组肺W/D显著低于损伤对照组,也进一步证实了新疗法能够明显减轻烟雾吸入导致的肺水肿程度。PAU用来量化动物呼吸困难时支气管收缩的严重程度[13],能够真实反映出呼吸道的阻塞程度[14-15]。本研究结果显示,动物给予新疗法处理后,其PAU显著低于损伤对照组,说明新疗法能够明显减轻烟雾吸入导致呼吸道阻塞及支气管收缩的严重程度,对肺功能具有明显的改善作用。通过以上结果初步证实了,丰诺安联合大剂量维生素B6对烟雾吸入性肺损伤具有明显的救治效果。

但是通过死亡率实验发现,治疗组动物的死亡率不但没有明显改善,反而显著升高。究其原因可能是实验中给予动物的药物用量过大造成动物无法耐受而加重死亡的。按照动物种属将临床用药剂量进行换算后,每天给予大鼠的实际腹腔注射的药物体积约为14 mL,而文献报道的大鼠腹腔注射的最大耐受剂量约为3 mL。即便将新药分3次注射,其用量也远超过动物的耐受剂量。丰诺安是一种较高浓度的复合氨基酸注射液,大量的丰诺安注射到动物腹腔后很可能造成腹腔的大量腹水或持续炎症,同时膈肌上抬,限制了肺的正常扩张,影响通气功能。本研究结果也证实,救治组每分钟通气量显著低于损伤对照组及正常对照组,说明新药注射后明显影响的动物的通气功能。这可能是新疗法造成死亡率增加的一个重要原因。本研究提示,在下一步实验中,应该适当减少药物剂量或者使用更高浓度的浓缩剂型,如有可能也可以选择兔子或其他较大型的实验动物采用静脉滴注的方式给药。

1 孙磊,陈晟,蔡颖,等.军用密闭舱室烟雾吸入致雄性大鼠心、肺、肝、肾损伤的观察[J].第三军医大学学报,2017,39(6):499-503.

2 Sun L,Zhao X,Li D,et al.A dynamic smoke generation and nose-only inhalation exposure system for rats:preliminary results from studies of selected transportation materials[J].Inhal Toxicol,2014,26(14):897-907.

3 安辉,孙磊,周燕虹,等.烟气吸入性损伤对大鼠肺组织丝裂原活化蛋白激酶通路的影响[J].中华烧伤杂志,2008,24(4):278-282.

4 孙磊,李代波,曹佳.急性烟雾吸入性肺损伤药物治疗的研究进展[J].国际呼吸杂志,2011,5(8):624-629.

5 孙磊,陈晟,蔡颖,等.密闭舱室烟雾吸入性肺损伤的救治方案效果评价[J/CD].中华卫生应急电子杂志,2016,2(6):350-357.

6 孙磊,陈晟,蔡颖,等.军用密闭舱室有毒烟雾致急性肺损伤的组合救治方案的评价[J/CD].中华卫生应急电子杂志,2017,3(2):79-87.

7 顾新刚,岳茂兴,郑琦涵,等.丰诺安治疗危重病肝功能损害疗效观察[J].岭南急诊医学杂志,2009,14(6):123-125.

8 岳茂兴,夏锡仪,李瑛,等.1336例突发性群体性氯气中毒患者的临床救治[M/CD].中华卫生应急,2012:15-18.

9 岳茂兴,夏锡仪,周培根,等.大剂量维生素B6联用20AA复方氨基酸治疗二例鼠药溴敌隆中毒致凝血障碍出血者[J/CD].中华卫生应急电子杂志,2015,1(2):125-126.

10 Yamamoto Y,Enkhbaatar P,Sousse LE,et al.nebulization with gamma-tocopherol ameliorates acute lung injury after burn and smoke inhalation in the ovine model[J].Shock,2012,37(4):408-414.

11 秦环龙.肝功能不全时氨基酸代谢变化与支链氨基酸的治疗作用[J].肠外与肠内营养,2004,11(4):249-252.

12 岳茂兴,夏锡仪,李瑛,等.狭窄空间事故的特点及医学应急救援策略告[J].中国危重病急救医学杂志,2012,24(11):655-657.

13 Hamelmann E,Schwarze J,Takeda K,et al.Noninvasive measurement of airway responsiveness in allergic mice using barometric plethysmography[J].Am J Respir Crit Care Med,1997,156(3 Pt 1):766-775.

14 Elekes K,Helyes Z,Németh J,et al.Role of capsaicin-sensitive afferents and sensory neuropeptides in endotoxin-induced airway inflammation and consequent bronchial hyperreactivity in the mouse[J].Regul Pept,2007,141(1-3):44-54.

15 Helyes Z,Elekes K,Németh J,et al.Role of transient receptor potential vanilloid 1 receptors in endotoxin-induced airway inflammation in the mouse[J].Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol,2007,292(5):1173-1181.

Effectofnewtherapyof20AAcompoundaminoacidplushighdoseofvitaminB6onacutelunginjuryinducedbysmokeinhalationinairtightcabins

SunLei1,CaiYing1,AoLin1,LiuJinyi1,TaoChengyu2,YueMaoxing3,CaoJia1.

1InstituteofToxicology;ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400038,China;2DepartmentofAmbulantClinic,PLAAcademyofArmoredForces,Bengbu233010,China;3SpecialMedicalCenter, 306thHospialofPLA,Beijing100101,China

CaoJia,Email:caojia1962@126.com

ObjectiveTo evaluate the effect of a new therapy of 20AA compound amino acid injection plus high-dose vitamin B6on acute lung injury induced by smoke inhalation in airtight cabins.MethodsA total of 48 male SD rats were randomly divided into control group, injury group and treatment group, with 16 rats per group. Rats in the control group inhaled the fresh air freely and were injected intraperitoneally with 70 mL/kg physiological saline for three days. Rats in the injury group were injected intraperitoneally with 70 mL/kg physiological saline for three days after nose-only smoke inhalation for 10 minutes. Rats in the treatment group were injected intraperitoneally with 50 mL/kg 20AA compound amino acid injection plus 1 g/kg vitamin B6(50 mg/mL) for three days after nose-only smoke inhalation for 10 minutes. Survival time and poisoning manifestations, lung function, pathological changes and lung wet-to-dry weight (W/D) ratio were observed and compared in three group.ResultsAfter smoke inhalation, breathing difficulties and some mental symptoms were observed immediately. Compared with the injury group, the mortality in the treatment group was increased (60% vs 40%),while the difference of survival time between the injury group and treatment group was not statistically significant (χ2=0.684,P=0.165). Lung edema and diffuse hemorrhage were observed in rats after smoke inhalation, and the degree of lung injury in the treatment group was lower than that in the injury group. Lung W/D ratio in the injury group was increased significantly compared with the control group [(5.02±0.13) vs (4.71±0.13),P=0.003]. W/D ratio in the treatment group was decreased significantly compared with the injury group [(4.76±0.18) vs (5.02±0.13),P=0.012]. PAU in the injury group was increased significantly compared with the control group [(1.93±0.58) vs (1.33±0.17),P=0.027]. PAU and EF50 in the treatment group were decreased significantly compared with the injury group [(1.29±0.43) vs (1.93±0.58),P=0.027; (0.58±0.15) mL/sec vs (1.19±0.40) mL/sec,P=0.035].ConclusionThe treatment of 20AA compound amino acid injection plus high-dose vitamin B6can significantly improve the lung function and alleviate acute lung injury induced by smoke inhalation However, the mortality of rats is increased after smoke inhalation because of intolerance of the large dose of intraperitoneal injection of above liquids.

Airtight cabin; Smoke inhalation; Acute lung injury; Compound amino acid; Vitamin B6

10.3877/cma.j.issn.2095-9133.2017.04.004

全军部队卫生和疾病防控应用性研究指令性课题(13BJYZ28)

400038 重庆,第三军医大学军事预防医学院毒理学研究所1;233010 安徽 蚌埠,解放军装甲兵学院门诊部2;100101 北京,解放军第三○六医院特种医学中心3

曹佳,Email:caojia1962@126.com

2017-07-29)

(本文编辑:楚鹰)

孙磊,蔡颖,敖琳,等.20AA复方氨基酸联用大剂量维生素B6对密闭舱室烟雾吸入性肺损伤救治效果研究[J/CD].中华卫生应急电子杂志,2017,3(4):212-217.