TLR9-mRNA的表达与急性胰腺炎病人炎性因子变化的相关性研究

杨宏达 刘志

TLR9-mRNA的表达与急性胰腺炎病人炎性因子变化的相关性研究

杨宏达 刘志

目的探讨单核巨噬细胞TLR9-mTLR9-mRNA的表达与急性胰腺炎(AP)病人炎性因子变化的相关性。方法24小时内被诊断为AP的病人40例，分别于第1，3，5天采集病人的EDTAK2抗凝静脉血，并检测胰弹性蛋白酶、促炎细胞因子和抗炎细胞因子。分离外周血单个核细胞，采用逆转录聚合酶链式反应对TLR9-mRNA进行检测，分析其5天内表达变化规律。结果所有AP病人在第 1天、第3天、5天时单核巨噬细胞 TLR9-mRNA对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。AP病人外周血单核巨噬细胞TLR9-mRNA的改变与胰弹性蛋白酶、促炎细胞因子呈明显正相关，差异有统计学意义(P<0.05)。结论外周血单核巨噬细胞TLR9-mRNA的表达改变与AP病人炎性因子(胰弹性蛋白酶、促炎细胞因子)表达上调有相关性，TLR9可能介导AP的发生与发展。

急性胰腺炎； 胰弹性蛋白酶； 促炎细胞因子； 抗炎细胞因子； 单核巨噬细胞TLR9-mRNA

急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)是由于多种原因导致胰酶被激活，而引起胰腺组织自身消化、水肿、出血甚至坏死的炎症反应，以血、尿淀粉酶增高为主要表现[1]。临床上常表现为腹痛、呕吐、发热等症状[2]。临床上根据预后分型，预后良好者为轻型急性胰腺炎；预后不良、发生胰腺出血坏死，并继发感染、腹膜炎，甚至休克者为重型急性胰腺炎。统计显示，AP发病率不断上升，治疗效果不理想，主要是因为目前研究尚未明确AP的发生、发展机制，以及未能认识疾病发生的始动环节以及分子生物学基础[3]。在AP分子生物学机制的研究中，Toll样受体(Toll-like receptors，TLRs)已成为备受关注的一种哺乳动物细胞表面信号传导跨膜蛋白，它在炎性反应的发生过程中起着重要的介导作用[4]，其中，TLR9是TLRs中的一种重要受体，它主要通过识别外源性的非甲基化CpG基序来启动炎症的链性反应[5]。我们对单核巨噬细胞TLR9-mRNA的表达与急性胰腺炎病人炎性因子变化的相关性进行探讨。

对象与方法

一、对象

2016年2月～2016年9月本院急诊科于24小时内诊断为AP的病人40例，男性23例，女性17例，平均年龄(52.32±3.21)岁。入院时的40例病人为对照组，实验组按时间分组，分为第1天组、第3天组和第5天组。纳入标准：年龄≤60岁；临床确诊为AP；无其它严重系统性疾病。排除标准：临床未诊断为AP；伴有其它系统严重性疾病；不愿参加本次研究者。所有AP病人年龄、性别和病情等基本资料比较差异无统计学意义(P>0.05)。

二、方法

分别采用人淋巴细胞分离液、Ficoll Taq DNA聚合酶、Trizol试剂和Rever Tra Ace逆转录酶。所有AP病人分别于第1、3、5天采集静脉血，EDTAK2抗凝，并检测其胰弹性蛋白酶、促炎细胞因子和抗炎细胞因子。分离外周血单个核细胞，采用逆转录聚合酶链式反应对TLR9-mRNA进行检测，分析其表达规律。

以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)作为内参照半定量，各样本表达强度由各样本灰度值/GAPDH灰度值计算所得。利用自动生化仪测定淀粉酶和脂肪酶含量，利用全自动定量绘图标仪测量细胞因子含量。

三、统计学处理

结 果

1.对照组与第1、3、5天时的单核巨噬细胞TLR9mRNA表达含量比较：所有AP病人在第1天、第3天、5天时单核巨噬细胞TLR9mRNA与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。说明单核巨噬细胞TLR9在AP炎症反应过程中起着重要的作用，也就能间接推测AP能诱导单核巨噬细胞TLR9的强烈表达。

2.对照组与第1、3、5天时的淀粉酶与脂肪酶含量比较：在第1天、第3天时的淀粉酶、脂肪酶含量与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)；第5天时的淀粉酶、脂肪酶含量与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。AP病人的淀粉酶、脂肪酶与胰腺的自身免疫反应有关，单核巨噬细胞TLR9的高表达可能介导炎症反应。见表1。

表1 对照组在入院时与第1、3、5天时的淀粉酶、脂肪酶含量比较

注：与对照组比较，aP<0.05

3.比较对照组与第1、3、5天时的细胞因子检测结果：第3天和第5天时，细胞因子TNF-α、IL-1含量与对照组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。第1 天时IL-4含量与对照组比较差异具有统计学意义(P<0.05)，这说明在AP病人前一周内单核巨噬细胞TLR9mRNA的表达变化与炎性因子有一定相关性，单核巨噬细胞TLR9mRNA是AP炎症反应中的介导因子。见表2。

表2 对照组在入院时与第1、3、5天时的细胞因子检测结果关系比较

注：与对照组比较，aP<0.05

讨 论

AP在我国该病发病率不断上升，病死率高，目前尚未明确该疾病发生和发展的分子生物学机制[6-7]。有报道发现，TLR9的高水平表达在免疫反应中发挥着重要作用，它可能通过识别外源性的非甲基化CpG基序来启动炎症的链性反应[8-9]。TLR9作为一类新的哺乳动物细胞表面信号传导跨膜蛋白，主要表达于B细胞、树突细胞等免疫细胞，甚至在非免疫细胞或肿瘤细胞上也有高水平表达[10]。

有研究发现，在大鼠的胰腺组织中，采用免疫组化方法发现TLR9主要表达在胰管上皮细胞[11]。一种被广泛认可的观点是胰管黏膜屏障是胰腺自我保护机制，是一种物理性的机械隔离机制，也是一种化学性保护机制[12]。单核巨噬细胞TLR9作为先天性免疫系统的重要一员，它可能在参与到胰管黏膜屏障的抗炎调节中，并与释放的其它细胞因子、促炎性因子等起调节作用，单核巨噬细胞TLR9也可能是免疫反应中一个潜在的调节点[13]。另有研究表明，单核巨噬细胞TLR9参与了AP病人早期炎症反应的血管微循环损害，同时发现人类AP能够诱导TRL9mRNA快速而强烈地表达[14]。

有研究发现，在人外周血单核细胞中，TLR9-mRNA呈现低水平的表达，但其在早期AP时的水平显著升高。所有AP病人的单核巨噬细胞TLR9在第1天时相对于对照组上调8.12倍，差异有统计学意义。在第3、5天时相对于对照组缓慢上调，其中，在第5天时上调至峰值，分别相对于对照组上调9.01倍和9.52倍，差异有统计学意义[14]。上述研究表明，TLR9对AP反应敏感，可短时间内呈现快速升高的趋势，可进一步推断其在AP疾病的发生、发展过程中可能起到显著的作用。有研究表明，CpG并不能够诱导单核巨噬细胞TLR9表达上调，但AP病人的炎症反应可以促使单核巨噬细胞TLR9表达上调[14]。说明单核巨噬细胞TLR9在AP炎症反应过程中起着重要作用，也就能间接推测AP能诱导单核巨噬细胞TLR9的表达。本研究通过逆转录聚合酶链式反应对TLR9-mRNA的表达进行检测，结果发现，第1天时、第3天时淀粉酶、脂肪酶含量与对照组比较差异有统计学意义；第5天时，淀粉酶、脂肪酶含量接近于基准水平值，与对照组差异无统计学意义。该结果表明，AP病人的淀粉酶与脂肪酶与胰腺的自身免疫反应有关，单核巨噬细胞TLR9的高表达可能介导本次炎症反应。单核巨噬细胞TLR9表达水平的升高与血清中的部分细胞因子增加存在显著关系。此外，既往研究指出，TLR9好激活能够大量释放IL-6、IL-10、IL-1、IL-12及TNF-α等促炎症细胞因子[15]。本研究发现，第3天和第5天时，细胞因子TNF-α与IL-1含量与对照组比较差异有统计学意义。第1天时IL-4含量与对照组比较差异有统计学意义。本研究发现，在AP病人前5天内的细胞因子检测中，虽然细胞因子TNF-α与IL-1在炎症过程中，随着时间不断上调，单核巨噬细胞TLR9mRNA的表达水平也不断升高，但IL-4没有随着单核巨噬细胞TLR9mRNA的表达水平的升高而持续上调。结果说明，单核巨噬细胞TLR9mRNA在AP病人炎症反应过程中起主要介导作用，淀粉酶与脂肪酶在逐渐降低的时候，单核巨噬细胞TLR9mRNA表达水平仍在升高，细胞因子IL-4逐渐降低时，单核巨噬细胞TLR9mRNA表达水平仍在升高。这说明在AP病人前一周内单核巨噬细胞TLR9mRNA的表达变化与炎性因子有一定相关性，单核巨噬细胞TLR9mRNA是AP炎症反应中的介导因子，或者只是AP发生、发展过程中的一种单纯的促炎性因子介质，可能与疾病的预后和病情严重程度有一定关系。

在AP病人前一周内单核巨噬细胞TLR9mRNA的表达变化与炎性因子有一定相关性，单核巨噬细胞TLR9mRNA在AP病人炎症反应过程中起重要的介导因子作用。

[1] 桂海波，陈雪梅.高三酰甘油血症性急性胰腺炎的研究新进展[J].医学综述，2016，22(21)：4245-4249.

[2] Hua Z，Su Y，Huang X，et al.Analysis of risk factors related to gastrointestinal fistula in patients with severe acute pancreatitis：a retrospective study of 344 cases in a single Chinese center[J].BMC Gastroenterol，2017，17(1)：29.

[3] 杨宁，郝建宇，张冬磊.高脂血症性和胆源性急性胰腺炎患者血钙和全段甲状旁腺素的变化及其与病情的相关性[J].中华胰腺病杂志，2015，15(5)：302-305.

[4] 姚建辉，范震.急性胰腺炎反应期C反应蛋白测定对病情严重程度的评估[J].昆明医科大学学报，2015，36(10)：107-110.

[5] Mirhashemi S，Soori M，Faghih G，et al.Scrotal Abscess：A Rare Presentation of Complicated Necrotizing Pancreatitis[J].Arch Iran Med，2017，20(2)：124-127.

[6] 李盛，胡炎军，朱求实.急性胰腺炎病人血小板平均容积测定的意义[J].腹部外科，2015，28(5)：363-366.

[7] Haddad JD.Acute Pancreatitis[J].N Engl J Med，2017，376(6)：597.

[8] ChE F，Vege SS，Wilcox CM.Acute Pancreatitis[J].N Engl J Med，2017，376(6)：598-599.

[9] 刘圆圆，江迈红，戴光荣.高脂血症性急性胰腺炎和胆源性急性胰腺炎临床特征分析[J].临床急诊杂志，2013，44(12)：976-979.

[10] 尼玛旦周，措羊.中度急性胰腺炎临床特征分析[J].肝胆胰外科杂志，2014，26(4)：285-288.

[11] 罗旭，叶劲松，梁昭.BISAP评分对急性胰腺炎严重程度的预测价值研究[J].养生保健指南，2016，(17)：172-173.

[12] 江帆，黎建军，吴国俊，等.急性重症胰腺炎患者早期肠内外营养支持的效果评价[J].临床急诊杂志，2013，14(12)：578-579.

[13] Rijkers AP，van Eijck CH.Acute Pancreatitis[J].N Engl J Med，2017，376(6)：596-597.

[14] Donnelly PE，Winch DE.Acute Pancreatitis[J].N Engl J Med，2017，376(6)：597.

[15] Johnson JR.Acute Pancreatitis[J].N Engl J Med，2017，376(6)：598.

Studyontherelationshipbetweentheexpressionoftoll-likereceptor9-mRNAandinflammatoryfactorsinpatientswithacutepancreatitis

YANGHongda，LIUZhi.

(DepartmentofEmergency，theFirstAffiliatedHospitalofChinaMedicalUniversity，Shenyang110001，China)

ObjectiveTo investigate the correlation between the expression of Toll-like receptor 9(TLR9)-mRNA and inflammatory factors in patients with acute pancreatitis(AP).MethodsA total of 40 patients with AP diagnosed in our hospital from February 2016 to September 2016 in 24 h were enrolled.EDTAK2 anticoagulant venous blood was collected on day 1，3，5.And pancreatic elastase，proinflammatory cytokines and anti-inflammatory cytokines were detected.Peripheral blood monouclear cells were isolated and the mRNA expression of TLR9 was tested by polymerase chain reaction.The change of TLR9-mRNA in 5 days was analyzed.ResultsThe level of TLR9-mRNA in peripheral blood mononuclear cells of patients with AP at 1，3，5 days were significantly higher than that in the control group，and the difference was statistically significant(P<0.05).Changes of the TLR9-mRNA expression in peripheral blood mononuclear cells in patients with AP was positively correlated with the levels of pancreatic elastase and proinflammatory cytokines，and the difference was statistically significant(P<0.05).ConclusionThe expression of TLR9-mRNA in peripheral blood mononuclear macrophages was closely related to the up-regulation of inflammatory cytokines in AP patients，suggesting that TLR9 may mediate the occurrence and development of AP.To investigate the correlation between the expression of TLR9-mTLR9-mRNA and inflammatory factors in patients with AP.MethodsA total of 40 patients with AP diagnosed in our hospital from February 2016 to September 2016 in 24h were selected.EDTAK2 anticoagulant venous blood was collected on day 1，3，5.And Pancreatic elastase，proinflammatory cytokines and anti-inflammatory cytokines were also detected.EDTAK2 anticoagulant venous blood was collected，tested the above indicators and used them as the benchmark level of the corresponding indicators.ResultsThe levels of TLR9-mRNA in peripheral blood mononuclear cells of patients with AP at 1，3，5 days were significantly higher than in the control group，and the difference was statistically significant(P<0.05).Changes of TLR9-mRNA expression in peripheral blood mononuclear cells in patients with AP was positively correlated with pancreatic elastase and proinflammatory cytokine，and the difference was statistically significant(P<0.05).ConclusionThe expression of TLR9-mRNA in peripheral blood mononuclear macrophages was closely related to the up regulation of inflammatory cytokines in AP patients，suggesting that TLR9 may mediate the occurrence and development of AP.

acute pancreatitis； pancreatic elastase； proinflammatory cytokines； inflammatory cytokine； macrophage TLR9-mRNA

10.3969/j.issn.1005-6483.2017.12.013

110001 沈阳，中国医科大学附属第一医院急诊科

刘志，Email：39050206@qq.com

2017-04-01)

杨泽平)