氢气吸入对长时程心脏骤停复苏后家猪心功能的保护作用

文才 余涛 翟小竹 杨正飞 蒋龙元 唐万春

·论著·

氢气吸入对长时程心脏骤停复苏后家猪心功能的保护作用

文才 余涛 翟小竹 杨正飞 蒋龙元 唐万春

目的探究氢气吸入对长时程心脏骤停(CA)家猪心肺复苏(CPR)后的心功能保护作用。方法选择健康雄性家猪20头，3月龄，体重(38±3)kg电诱发室颤并维持10 min后开始CPR。动物恢复自主循环(ROSC)后随机分为对照组和氢气组：对照组ROSC后全程使用普通空气进行机械通气；氢气组ROSC后使用2% 氢气(H2∶O2∶N2=2%∶21%∶77%)进行通气，至复苏后2 h改普通空气通气。持续监测血流动力学参数包括心率、平均动脉压、左室内压最大上升或下降速率(±dp/dtmax)、心指数等，分别于复苏后0.5，2，4和6 h检测动脉血气、乳酸水平及血清心肌损伤标志物肌钙蛋白T(cTnT)、B型氨基端利钠肽原(NT-pro-BNP)的浓度，观察动物CPR后96 h的生存结局。结果复苏后两组动物心功能均有下降，氢气治疗组动物心功能较对照组好，氢气组心功能参数复苏后5 h和6 h时[+dp/dtmax分别为(3320.1±433.4)mmHg/s和(3294.5±390.4)mmHg/s；-dp/dtmax分别为(3756.1±498.8)mmHg/s和(3667.4±406.8)mmHg/s；心指数分别为(6.8±1.0)L/min·m2和(6.7±1.2) L/min·m2]高于同时间点的对照组[+dp/dtmax分别为(2863.5±340.8)mmHg/s和(2925.2±251.3)mmHg/s；-dp/dtmax分别为(3245.4±259.6)mmHg/s和(3261.9±311)mmHg/s、心指数分别为(5.3±1.5)L/min·m2和(5.1±1.4)L/min·m2]，差异均有统计学意义(P均<0.05)；复苏后4 h和6 h时氢气组血清cTnT分别为(2.7±0.9 )ng/mL和(2.7±0.8)ng/mL、NT-pro-BNP分别为(0.34±0.13)ng/mL和(0.37±0.17)ng/mL)浓度低于对照组 cTnT分别为(4.9±1.2)ng/mL和(5.8±1.2)ng/mL、 NT-pro-BNP：分别为(0.54±0.12)ng/mL和(0.78±0.21)ng/mL浓度，差异均有统计学意义(P均<0.05)。氢气组动物CPR后生存时间明显较对照组长[氢气组vs. 对照组(h)：96(25，96)vs 16(12，22)]，差异有统计学意义(P<0.05)。结论CPR后氢气吸入可改善长时程心脏骤停家猪CPR后的心功能和生存结局。

心脏骤停; 心肺复苏; 心功能障碍； 氢气

心脏骤停(cardiac arrest，CA)是目前全球范围内引起死亡的主要原因之一[1]。尽管救治策略在不断改进，但CA患者的总体出院存活率仍不到10%[2-3]。心肺复苏术(cardiopulmonary resuscitation，CPR)后心功能障碍是患者的主要死亡原因之一[4]。分子氢作为一种新型的抗氧化剂，其对多种疾病治疗的有效性不断得到证实[5-6]。Hayashida等[7]和Wang等[8]先后指出，CPR后氢气吸入能有效的改善CA大鼠的心功能及生存结局。然而，大鼠模型在解剖生理特征以及病理生理机制等方面与人体存在较大的差异[9-10]。现实生活中，急救人员通常至少需8 min才能赶赴院外CA患者救治现场[11]，而上述两项研究中采用的大鼠模型CA时程仅为5 min[7-8]。H2若要作为一种新的CPR后治疗方法应用于临床，其安全性和有效性仍需在更多的长时程、大动物CA模型上进行验证。本实验通过右心致颤法建立10 min CA家猪模型，探讨氢气对CPR后动物心功能的保护作用。

资料与方法

一、实验动物与材料

1.实验动物：国产健康雄性家猪20只，3月龄，体重(35±3) kg，购自华南农业大学原种猪场(生产许可证号:粤0000120，实验动物使用许可证号SYXK(粤)2011-2012)。本实验在中山大学孙逸仙纪念医院唐万春急危重症医学实验室进行，实验前动物禁食12 h，但不禁水。

2.实验试剂：氯胺酮注射液(福建古田药业有限公司)、戊巴比妥钠(德国,Sigma公司)、盐酸肾上腺素注射液(中国，福州海王福药制药有限公司)，肌钙蛋白T(cardiac troponin T,cTnT)、B型氨基端利钠肽原(N-terminal pro-B-type natriuretic peptide,NT-pro-BNP)检测试剂盒(美国,Cell Biolabs公司)。

3.主要实验仪器：监护仪(中国,深圳迈瑞公司)、LinkCPR 人工按压质量反馈仪(中国,SunLife公司)、除颤仪(美国,ZOLL公司)、一次性除颤电极(美国,ZOLL公司)、血气分析仪(丹麦,RADIOMETER公司)、Swan-Ganz导管与压力传感器(美国,EDWARDS公司)、Windaq数据采集分析系统(美国,DATAQ公司)。

二、实验方法

(一)实验动物建模方法

1.手术置管：(1)动物予肌注氯胺酮20 mg/kg进行诱导麻醉(氯胺酮规格为0.1 g∶2 mL，家猪体重按35 kg计算，预计需氯胺酮700 mg，肌注前将药品使用生理水稀释至30 mL备用)，建立耳缘静脉通道后，静脉注射戊巴比妥钠30 mg/kg进行全身麻醉(使用前将3 g戊巴比妥钠加入100 mL等渗盐水进行溶解，配置成30 g/L戊巴比妥钠溶液备用)，此后以戊巴比妥钠8 mg·kg-1·h-1维持麻醉。(2)静脉全身麻醉后，经口气管插管并行机械通气，取定容模式，设置潮气量为10 mL/kg、吸入氧浓度(fraction of inspired oxygen，FiO2)为 21%，调整呼吸频率12～20次/min，以维持呼吸末二氧化碳分压(End-tidal CO2，ETCO2)在35～40 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)水平。通过双上肢与左下肢心电电极，行常规 Ⅱ 导联心电图持续监测。(3)手术分离右股动脉，置入Swan-Ganz导管用于主动脉血压(aortic pressure，AP)监测以及动脉血标本采集；暴露右股静脉，置入Swan-Ganz导管用于监测右心房压(right atrial pressure，RAP)、核心体温，以及静脉血标本采集；此外，尚充当脉搏指示连续心排血量监测(pulse-induced contour cardiac output，PiCCO)静脉导管用于经肺热稀释法心输出量(cardiac output，CO)的测定。(4)分离左股动脉，置入PiCCO动脉导管；同时分离右颈外静脉，用于右心室致颤电极的置入。

2.模型制备：(1)诱导心室颤动(简称“室颤”)前，采集动物的基础数据。经右心电极予 2mA交流电诱导室颤：以心电图呈室颤波形、平均动脉压下降至<30 mmHg、搏动波形消失，为室颤诱导成功标志，同时中断呼吸机通气。(2)维持无处理室颤状态10 min后，按照30∶2按压通气比进行人工CPR。使用LinkCPR 人工按压质量反馈仪监测按压质量，以保证按压深度为5～6 cm、按压频率100～120次/min，所有模型动物在CPR过程中均予100%纯氧通气。(3)CPR 2 min时经中心静脉导管注射肾上腺素(原液)20 μg/kg，若经上述抢救无恢复自主循环(restoration of spontaneous circulation，ROSC)，则其后每4 min CPR追加给予肾上腺素静脉注射一次；CPR 6 min时若仍呈室颤心律，则进行除颤(能量3 J/kg)，无ROSC则之后每2 min CPR追加进行一次除颤(能量4 J/kg)。

ROSC标准为动物自主心律恢复伴平均动脉压(mean arterial pressure，MAP)≥60 mmHg，且持续时间≥5 min。持续CPR≥20 min无ROSC则视为复苏失败。

(二)动物分组

20只动物诱导室颤10 min并成功复苏18只，将其按随机数字法分为对照组和氢气组，每组9只。对照组动物ROSC后，全程使用普通空气行机械通气(FiO2=21%)；氢气组动物ROSC后，使用含2%氢气的混合气体(H2:O2:N2=2%:21%:77%)进行通气，至复苏后2 h为普通空气通气。

连云港市灌南县原政法委书记汪建新，为徐某某在灌南农业园区投建杏鲍菇生产企业征地拆迁等方面提供帮助，徐为此送上5万元现金。次日汪即安排工作人员退还。汪建新先后在多个单位任职，每每离任之际，都要上交别人对其的行贿款项——他交到三口镇财政所18万元，新安镇财政所15万元，上交灌南县纪委57万元。看来，汪建新是个不可多得的“廉洁”官员。然而，案发后江苏省高级人民法院终审以贪污罪、受贿罪、滥用职权罪判处汪有期徒刑十五年。

(三)基础生理及复苏结果

两组动物建模前的基础生理参数及初始复苏结果方面的差异均无统计学意义(P均>0.05)，具有可比性。见表1。

本实验获中山大学动物伦理委员会批准实施(决议编号：LAEC-2012-0801))，动物处置方法符合动物伦理学标准。

三、观察指标

1.血统动力学监测：持续监测动物的心电变化、心率、血压等，CPR前及CPR后的每小时使用PiCCO设备监测动物的心指数(cardiac index，CI)和左室内压最大上升速率(+dp/dtmax)或左室内压最大下降速率(-dp/dtmax)。

2.血气及血清学检测：检测两组动物PR0.5，2，4和6 h时动脉血气分析[酸碱度(pH)、动脉血氧分压(arterial partial pressure of oxygen，PaO2)和动脉血二氧化碳分压(arterial partial pressure of carbon dioxide，PaCO2)、乳酸水平，并使用ELISA法检测血清标志物 cTnT和NT-pro-BNP的浓度。

3.记录动物CPR后96 h的生存情况。

四、统计学分析

表1 两组长时程CA家猪在建模前的基础生理参数及初始复苏结果的比较

注：CA为心脏骤停，MAP为平均动脉压，pH为酸碱度，PaO2为动脉血氧分压，PaCO2为动脉血二氧化碳分压，CPR为心肺复苏

结 果

一、两组动物动脉血气分析与乳酸水平比较

两组动物复苏后0.5，2，4和 6 h动脉血气分析及乳酸水平差异无统计学意见。见表2。

表2 两组长时程CA家猪CPR后动脉血气分析和乳酸水平的比较

注：CA为心脏骤停，pH为酸碱度，PaO2为动脉血氧分压，PaCO2为动脉血二氧化碳分压

二、两组动物血流动力学与心功能比较

复苏后两组动物均出现心率增快、平均动脉压下降的趋势，但组间差异无统计学意义(P>0.05)。见图1～2。±dp/dtmax是反映左心室收缩和舒张功能的重要指标，复苏后两组动物±dp/dtmax均呈现下降的趋势，氢气吸入组相对高于对照组，尤以复苏后2，5和 6 h时两组间差异较大(P均<0.05)，这与另一心功能指标CI的变化一致。见图3～5。

注：CA为心跳骤停，PCR为心肺复苏，BL为建模前基础状态，PR为复苏后

图1两组长时程CA家猪复苏前后心率比较

注：CA为心跳骤停，CPR为心肺复苏，BL为建模前基础状态，PR为复苏后

图2两组长时程CA家猪复苏前后平均动脉压比较

注：CA为心跳骤停，PCR为心肺复苏，+dp/dtmax为左室内压最大上升速率，BL为建模前基础状态，PR为复苏后；与同一时间点对照组比较:aP<0.05

图3两组长时程CA家猪复苏前后+dp/dtmax比较

注：CA为心跳骤停，PCR为心肺复苏，-dp/dtmax为左室内压最大下降速率，BL为建模前基础状态，PR为复苏后；与同一时间点对照组比较:aP<0.05

图4两组长时程CA家猪复苏前后-dp/dtmax比较

注：CA为心跳骤停，PCR为心肺复苏，BL为建模前基础状态，PR为复苏后；与同一时间点对照组比较:aP<0.05

图5两组长时程CA家猪复苏前后心指数比较

三、两组动物血清心肌损伤标志物

复苏后两组动物血清心肌损伤标志物cTnT、NT-pro-BNP浓度均有不同程度的升高，氢气吸入组升高幅度相对较小，PR4、6 h时两组间差异有统计学意义(P均<0.05)。见图6～7。

注：cTnT为心肌肌钙蛋白T，BL为建模前基础状态，PR为复苏后；与同一时间点对照组比较，a为P<0.05

图6两组长时程CA家猪复苏前后血清cTnT比较

注：NT-pro-BNP为B型氨基端利钠肽原，BL为建模前基础状态，PR为复苏后；与同一时间点对照组比较：aP<0.05

图7两组长时程CA家猪复苏前后血清NT-pro-BNP浓度比较

四、两组动物生存分析

氢气组动物复苏后存活时间明显长于对照组，96 h存活率为44.4%(5/9)，高于对照组的11.1%(1/9)，差异有统计学意义(P<0.05)。见图8。

注：与对照组比较：aP<0.05

图8两组长时程CA家猪CPR后96 h Kaplan-Meier生存分析

讨 论

CPR后心功能障碍是CA患者低生存率的主要原因之一[4]。研究显示，ROSC后30 min即可出现复苏后心功能不全的现象，称为复苏后心肌顿抑[12-13]。研究发现，此时的心肌组织并非永久性的损伤或梗死，仍然是可逆和可防治的[14-15]。本研究结果也显示，长时程CA家猪经CPR后心功能明显受损，表现为心功能指标±dp/dtmax、心指数下降以及心肌损伤血清标志物cTnT、NT-pro-BNP浓度的升高。而氢气治疗组动物的±dp/dtmax、CI下降和cTnT、NT-pro-BNP浓度升高幅度更小，说明氢气可能对CPR后心功能具有直接保护作用。本研究结果还显示，氢气吸入的动物在CPR后心率和MAP的变化上与对照组间的差异无统计学意义，说明氢气对CPR后动物的心脏节律和外周血压调节等影响不大，氢气吸入治疗可能并非通过相关机制来发挥其心脏保护作用。

前期研究显示，分子氢作为一种新型的抗氧化剂，能轻易地透过细胞膜，到达线粒体、细胞核等目标细胞器，并选择性地清除细胞内羟自由基等有害活性氧自由基而不过多干扰细胞的正常氧化还原代谢反应[16]。此外，许多研究显示，分子氢还具有抗炎、抗凋亡、保护线粒体功能等作用[5-6]。Hayashida等[7]的研究发现，复苏后吸入氢气的大鼠心肌组织中氧化损伤标志物8-羟基脱氧鸟苷(8-hydroxy-2-deoxyguanosine, 8-OHdG)及4-羟基壬烯醛(4-hydroxynonenal, 4-HNE)呈阳性心肌细胞明显更少，说明氢气能有效改善CPR后大鼠心功能，至少能说明部分机制可能是通过清除心肌组织中过多的氧自由基来实现的。这些也可能是氢气对大型动物CPR后心功能保护作用的机制，但确切的作用机制仍需进一步通过实验验证。

本课题组最先在国际利用大动物CA与CPR模型成功证实氢气能够改善CPR后心功能从而改善CPR的预后，发现CPR后予2%氢气吸入能有效降低长时程CA家猪血清心肌损伤标志物的水平，改善心脏的收缩和舒张功能，最终改善动物的生存结局。这为氢气可能应用于临床复苏后综合征的处理和治疗提供了重要的理论依据。

本研究结果显示，CPR后氢气吸入组与对照组动物在CPR后动脉血气以及乳酸水平上差异并无统计学意义，说明使用氢气吸入治疗对机体在气体交换以及氧耗等方面的影响较小。

本研究尚存在一定的局限性。首先，选用的实验动物均为健康家猪，这与临床中发生CA高危群体合并其他疾病的情况有所差别；其次，未从组织病理结构的角度说明氢气吸入对心肌的保护作用；第三，未对复苏后氢气心功能保护作用的具体机制进行深入的探讨；第四，尚未探讨不同给药浓度、给药方式对机体保护作用的差异。但作为临床前期的验证性研究，本研究已率先初步证实氢气在CPR后对心脏具有较好的保护作用且改善动物生存预后，这为今后将氢气向临床转化应用及进一步研究奠定了重要基础。

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Inhalationofhydrogenimprovesmyocardialfunctionandsurvivaloutcomesinaporcinemodelofprolongedcardiacarrest

WenCai,YuTao,ZhaiXiaozhu,YangZhengfei,JiangLongyuan,TangWanchun.

DepartmentofEmergency,SunYat-SenMemorialHospital,SunYat-SenUniversity,Guangzhou510120,China

JiangLongyuan,Email:jly1964@vip.163.com

ObjectiveTo investigate the beneficial effect of hydrogen(H2)on myocardial dysfunction after cardiopulmonary resuscitation (CPR) in a pig model with a prolonged cardiac arrest.MethodsHealthy domestic pigs were subjected to 10 minutes of ventricular fibrillation cardiac arrest induced electrically and followed by CPR. After achieving the return of spontaneous circulation (ROSC), the post-cardiac arrest pigs were randomized into two groups: mechanically ventilated with room air (control group); mechanically ventilated with 2% H2(H2∶O2∶N2=2%∶21%∶77%)for 2 hours after ROSC and turned to ventilate with room air (H2group). Hemodynamic parameters including HR, MAP, left ventricular pressure derivative (±dp/dtmax) and cardiac index (CI) were recorded for 6 hours continually after successful resuscitation. Arterial blood gas, lactate and serum marker of myocardial injury (cTnT and NT-pro-BNP) were measured at baseline, and at 0.5, 2, 4 and 6 hours after CPR. The survival outcomes of animals were evaluated and recorded until 96 hours after CPR.ResultsWorse post-resuscitation myocardial function was found in both groups compared to the status prior to CA, but the myocardial function of the H2group was superior to that of the control group. The indicators of myocardial function in the H2group especially at 5 hours and 6 hours after CPR [+dp/dtmax:(3320.1±433.4)mmHg/s and (3294.5±390.4)mmHg/s; -dp/dtmax:(3756.1±498.8)mmHg/s and (3667.4±406.8)mmHg/s; CI: (6.8±1.0) L/min·m2and(6.7±1.2)L/min·m2] were much better than those of the control group at the same time points [+dp/dtmax:(2863.5±340.8)mmHg/s and(2925.2±251.3) mmHg/s; -dp/dtmax:(3245.4±259.6)mmHg/s and (3261.9±311)mmHg/s; CI: (5.3±1.5)L/min·m2and(5.1±1.4)L/min·m2](allP<0.05). At 4 hours and 6 hours after CPR, the serum levels of cTnT and NT-pro-BNP in H2group [cTnT: (2.7±0.9)ng/mL and (2.7±0.8)ng/mL; NT-pro-BNP: (0.34±0.13)ng/mL and(0.37±0.17)ng/mL] were obviously lower compared to the control group [cTnT:(4.9±1.2)ng/mL and (5.8±1.2)ng/mL; NT-pro-BNP:(0.54±0.12)ng/mL and(0.78±0.21)ng/mL](allP<0.05). In addition, greater survival duration was also observed in H2group compared to the control group [96(25，96)hours vs. 16(12，22)hours, P<0.05].ConclusionInhalation of H2improves post-resuscitation myocardial dysfunction and survival outcomes in a porcine model with prolonged cardiac arrest.

Cardiac arrest; Cardiopulmonary resuscitation; Myocardial dysfunction; Hydrogen

10.3877/cma.j.issn.2095-9133.2017.02.006

国家自然科学基金(81000823)；广东省领军人才计划 (81000-42020004)；中山大学高校基本科研业务费青年教师培育项目(214ykpy22)

510120 广州，中山大学孙逸仙纪念医院急诊医学科

蒋龙元，Email：jly1964@vip.163.com

2017-03-15)

楚鹰)

文才,余涛,翟小竹,等.氢气吸入对长时程心脏骤停复苏后家猪心功能的保护作用[J/CD].中华卫生应急电子杂志,2017,3(2):92-97.