棉酚对糖尿病大鼠非酒精性脂肪性肝病纤维化的影响

李秧秧，陈涵斌，徐菲菲，万丽，陈国荣，陈垒，陈三妹，王蓉蓉

（1．温州医科大学附属第一医院 病理科，浙江 温州 325015；2．温州医科大学附属第一医院 放化疗科，浙江 温州 325015；3．温州医科大学 第一临床医学院，浙江 温州 325035；4．绍兴文理学院医学院护理系，浙江 绍兴 312000）

棉酚对糖尿病大鼠非酒精性脂肪性肝病纤维化的影响

李秧秧1，陈涵斌2，徐菲菲1，万丽1，陈国荣1，陈垒3，陈三妹4，王蓉蓉1

（1．温州医科大学附属第一医院 病理科，浙江 温州 325015；2．温州医科大学附属第一医院 放化疗科，浙江 温州 325015；3．温州医科大学 第一临床医学院，浙江 温州 325035；4．绍兴文理学院医学院护理系，浙江 绍兴 312000）

目的：研究棉酚对糖尿病大鼠非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）纤维化的影响及其可能机制。方法：雄性SD大鼠30只，随机均分成3组：正常对照（NC）组、2型糖尿病（T2DM）组、棉酚治疗（T2DMG）组。采用高脂饮食及低剂量链脲佐菌素（STZ）构建糖尿病大鼠模型，T2DMG组模型构建后用棉酚灌胃（15 mg·kg-1·d-1灌胃4周，再按每周15 mg·kg-1灌胃8周）。光镜及电镜下观察肝组织形态学改变；Masson染色观察肝组织纤维化病变；免疫组织化学检测肝组织α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、11β-羟类固醇脱氢酶1（11β-HSD1）、糖皮质激素受体（GR）、核转录因子-κB（NF-κB）及转化生长因子β1（TGFβ1）蛋白的表达；RT-PCR法检测肝组织11β-HSD1、GR、NF-κB及TGFβ1 mRNA表达。结果：与NC组比较，T2DM组肝组织明显纤维化，α-SMA、11β-HSD1、GR、NF-κB、TGFβ1蛋白表达明显增多（P=0.001、0.004、0.001、0.001、0.002），GR、TGFβ1 mRNA表达明显增加（P=0.01、0.001）；与T2DM组比较，T2DMG组肝纤维化病变明显减轻，肝组织α-SMA、11β-HSD1、GR、NF-κB、TGFβ1蛋白表达明显减少（P=0.009、0.031、0.002、0.009、0.027），11β-HSD1、GR、TGFβ1 mRNA表达明显减少（P=0.003、0.038、0.014）。结论：棉酚可以有效改善NAFLD相关肝纤维化病变，其机制可能是抑制肝脏11β-HSD1、GR、NF-κB、TGFβ1的表达。

肝纤维化；糖尿病；棉酚；11β-羟类固醇脱氢酶1；糖皮质激素受体；核转录因子-κB；转化生长因子β1

非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是常见的糖尿病并发症。在NAFLD的发病过程中，高糖致线粒体内超氧阴离子（O2-）产生过多，组织细胞内发生氧化应激，使肝星形细胞（hepatic stellate cell，HSC）激活，促进肝脏纤维化损伤。炎症反应启动及调节的关键因子核转录因子-κB（nuclear transcription factor-κB，NF-κB）与转化生长因子β1（transforming growth factor-β1，TGFβ1）可相互协同，在NAFLD肝纤维化过程中起重要作用。棉酚（gossy-pol）是一种黄色多酚羟基双萘醛类化合物，是锦葵科植物草棉、树棉或陆地棉成熟种子、根皮中提取的一种多元酚类物质，为11β-羟类固醇脱氢酶1（11β-hydroxysteroid dehydrogenase 1，11β-HSD1）抑制剂，可显著抑制大鼠、豚鼠以及人的11β-HSD1[1]，有效改变脂质过氧化代谢动力学[2]及拮抗肺纤维化[3]。本课题组前期研究证实棉酚可有效减轻胰岛素抵抗，降低糖尿病大鼠的血糖、血脂水平[4]。本研究通过观察棉酚对2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）大鼠NAFLD肝纤维化及11β-HSD1、糖皮质激素受体（glucocorticoid receptor，GR）、NF-κB、TGFβ1表达的影响，为糖尿病相关肝脏纤维化损伤的防治提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 模型复制与处理 雄性SD大鼠30只，体质量140～180 g，由温州医科大学实验动物中心提供，动物许可证号：SCXK（浙）2015-0004。随机均分成3组：正常对照（NC）组、2型糖尿病（T2DM）组、棉酚治疗（T2DMG）组。后2组通过高脂饮食建立T2DM大鼠模型，按文献[5]进行。NC组腹腔注射等容积0.1 mmol/L枸橼酸缓冲液。T2DMG组按15 mg·kg-1·d-1剂量棉酚灌胃4周，后以每周15 mg·kg-1剂量继续棉酚灌胃8周（棉酚+2%羧甲基纤维素，棉酚由美国洛克菲勒大学葛仁山教授惠赠）。T2DM组、NC组给予等容积的2%羧甲基纤维素灌胃，次数及时间同T2DMG组。实验期间T2DM组与T2DMG组持续供给高脂饮食，NC组供给普通饮食，实验结束后处死大鼠。

1.2 HE染色及评分标准[6]取新鲜肝组织1块（约10 mm×10 mm×2 mm），4%甲醛固定，脱水，透明，浸蜡及石蜡包埋，切片（厚度3 μm），HE染色及封固。NAFLD病变程度评分标准：①脂肪变性程度：随机选10个低倍视野（×100），0分为无脂肪变性，1分为脂肪变性范围＜33%，2分为脂肪变性范围33%～66%，3分为脂肪变性范围＞66%；②肝细胞小叶内炎症及汇管区炎症程度：随机选10个高倍视野（×200），0分为无炎症细胞，1分为炎症细胞1～2个，2分为炎症细胞2～3个，3分为炎症细胞≥4个。

1.3 Masson三色法及评分标准[6]各组肝组织切片、脱蜡、苏木素染色、分化，Masson液中染色5 min后水洗，亮绿液染色1 min，脱水，过石碳酸二甲苯，透明封固。结果判定：肝细胞呈红色，胶原纤维呈蓝绿色。纤维化评分：随机选择10个低倍镜视野（×100），0分为无纤维化，1分为肝小叶3区窦周或肝细胞外纤维化，2分为汇管区出现纤维化，3分为肝小叶纤维化与汇管区纤维化相互连接，形成桥接纤维化，4分为肝硬化（典型的假小叶出现）。

1.4 肝脏超微结构检查 取新鲜肝组织1小块（1 mm×1 mm×1 mm），即刻入2.5%戊二醛4 ℃固定，锇酸后固定，PBS漂洗及脱水。包埋及半薄切片定位后切片、行铅铀双重染色后电镜下观察（德国莱卡公司RM2245型石蜡切片机，日本日立公司H-7500型透射电镜机）。

1.5 免疫组织化学染色 各组肝组织切片后按Envision二步法染色。α-SMA、NF-κB为鼠单抗（稀释浓度为1：100），11β-HSD1、GR、TGFβ1为兔多抗（稀释浓度1：100）。结果判定：α-SMA、11β-HSD1、TGFβ1细胞胞浆显示棕黄色为阳性表达；GR细胞胞核显示棕黄色为阳性表达；NF-κB表达出现细胞浆阳性表达并出现核转位，发生细胞核表达为阳性表达。随机选择5个低倍镜视野（×100），应用Image-Pro Plus 6.0图像处理软件计算11β-HSD1、GR、NF-κB、TGFβ1累积光密度。按下列评分标准评估α-SMA的表达[7]：0分为无着色，1分为轻度（＜10%），2分为中度（11%～25%），3分为重度（26%～50%），4分为极重度（＞50%）。

1.6 RNA提取及RT-PCR 3组各取100 mg肝组织加1 mL Trizol（美国Invitrogen公司），提取大鼠肝组织的总mRNA。取2 μg总mRNA，用M-MLV反转录酶（美国Promega公司）合成cDNA（20 μL）。取1 μL cDNA为模板，在Taq DNA聚合酶（大连宝生物公司）催化下行肝脏11β-HSD1、GR、NF-κB、TGFβ1基因mRNA扩增（引物由上海Invitrogen公司合成）。PCR引物及反应条件见表1，用Gel-pro31凝胶分析系统进行分析，以目的基因和内参照RPS16基因的累积吸光度比值作为目的基因的相对水平。

表1 PCR引物及反应条件

1.7 统计学处理方法 用SPSS20.0统计软件进行分析。正态分布数据以 ±s表示，用单因素方差分析比较组间差异。偏态分布数据以M（P25，P75）表示，组间比较采用Mann-WhitneyU检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 光镜下形态学改变

2.1.1 HE染色：NC组肝小叶结构清晰，肝索整齐；T2DM组肝小叶结构紊乱，肝细胞明显水肿伴脂肪变性，并可见多灶区细胞点状坏死，伴小胆管增生及慢性炎细胞浸润；T2DM组脂肪变性、小叶间炎症、汇管区炎症与NC组比较差异有统计学意义（P＜0.01）。T2DMG组与T2DM组比较，脂肪变性、小叶间炎症、汇管区炎症稍改善，但差异均无统计学意义（P＞0.05）。见图1、表2。

2.1.2 Masson染色：NC组肝组织散在绿染的胶原纤维，均表达于血管壁，T2DM组胶原纤维明显增生，T2DMG组胶原纤维增生与T2DM组比较明显减轻。T2DM组与NC组纤维化评分比较差异有统计学意义（P=0.001），T2DMG组与T2DM组比较差异有统计学意义（P=0.035），见图2、表2。

图1 各组肝组织的病理变化（HE，×400）

表2 各组大鼠肝组织脂肪变性、小叶间炎症、汇管区炎症、纤维化、α-SMA评分（n=10， ±s）

2.2 电镜下形态学改变 NC组肝细胞核圆形居中，胞浆内线粒体、粗面内质网丰富，未见脂滴；T2DM组肝细胞核固缩偏位，线粒体减少、体积变小、密度增加，粗面内质网数目减少，胞浆内可见大量脂滴，狄氏窦胶原纤维增生，HSC明显增生；T2DMG组肝细胞线粒体数目稍增多、密度稍降低，板状嵴变清晰，胞浆内脂滴稍减少，粗面内质网数量与NC组相近，狄氏窦未见明显胶原纤维及HSC增生。见图3。

2.3 免疫组织化学染色结果 NC组肝组织未见α-SMA阳性表达的HSC，T2DM组肝组织内α-SMA阳性表达明显增多，与NC组比较差异有统计学意义（P=0.001），T2DMG组α-SMA表达阳性减少，与T2DM组比较差异有统计学意义（P=0.009），见表2。NC组11β-HSD1、TGFβ1细胞浆呈弱阳性表达，GR细胞核呈弱阳性表达，NF-κB细胞浆弱表达；T2DM组11β-HSD1、TGFβ1细胞浆表达明显增强，GR细胞核表达明显增强，NF-κB细胞浆表达增强且出现胞核表达，与NC组比较差异均有统计学意义（P=0.004、0.002、0.001、0.001）；T2DMG组11β-HSD1、TGFβ1细胞浆表达明显减弱，GR细胞核表达明显减弱，NF-κB细胞浆表达减弱，个别胞核弱表达，与T2DM组比较差异均有统计学意义（P=0.031、0.027、0.002、0.009），见表3。

2.4 mRNA表达结果 T2DM组肝组织GR、TGFβ1基因mRNA表达明显高于NC组（P=0.01、0.001）；11β-HSD1、NF-κB mRNA表达差异无统计学意义（P=0.443、0.438）。T2DMG组11β-HSD1、GR、TGFβ1 mRNA表达明显低于T2DM组（P=0.003、0.038、0.014），NF-κB mRNA表达差异无统计学意义（P=0.431），见表3。

3 讨论

图2 各组肝组织纤维化病变（Masson染色，×100）

图3 3组大鼠肝组织超微结构（TEM）

表3 各组大鼠肝组织11β-HSD1、GR、NF-κB、TGFβ1蛋白及mRNA表达水平比较（n=10， ±s）

NAFLD是常见的糖尿病并发症，伴随肝脏纤维化加重可进展为不可逆转的肝硬化甚至肝功能衰竭，导致NAFLD病死率上升[8]，因此，有效地治疗NAFLD具有重要的临床意义。11β-HSD1为糖皮质激素（glucocorticoid，GC）的代谢酶，具有氧化/还原两种活性，在肝脏内11β-HSD1主要以还原形式存在，可将无活性的皮质酮转化为有活性的皮质醇，增强GC的作用。GR属于保守的核受体超家族中的一员，大多数已知的GC的作用都是由GR介导。GC与GR结合，使糖异生的限速酶磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（phosphoenolpyruvate carboxykinase，PEPCK）和葡萄糖6磷酸酶（glucose-6-phosphatase，G6Pase）表达上调，加速糖异生的过程，对抗胰岛素的活性并使血糖升高。本课题组前期研究发现棉酚可有效改善胰岛素抵抗，降低糖尿病大鼠的血糖水平[4]，本研究发现T2DM大鼠肝组织11β-HSD1、GR蛋白表达明显增强，GR mRNA水平明显升高，提示糖尿病时11β-HSD1表达上调使GC的活性增强。经棉酚治疗后，11β-HSD1、GR蛋白表达及mRNA水平表达明显减少，提示棉酚可能通过抑制肝11β-HSD1，使肝脏局部的GC活性减弱，从而抑制糖异生作用，降低血糖。

NF-κB作为激活炎症反应启动及调节的关键因子，可诱导TNF-α、白细胞介素、黏附分子等的表达，对肝脏炎症后的纤维化病变起着重要作用[9]。在静息的细胞中，NF-κB和IκB形成复合体，并以无活性形式存在于胞浆中。当细胞受细胞外信号刺激后，IκB激酶复合体（IκB kinase，IKK）活化，将IκB磷酸化，使NF-κB暴露核定位位点并使游离的NF-κB迅速移位到细胞核（核转位）并激活炎症反应[10]。TGFβ1是最强的致肝纤维化细胞因子之一，它通过Smad或MAPK/ERK通路促进HSC增殖及活化[11]。HSC位于肝窦周隙内，正常情况下HSC处于静止状态，当机体出现氧化应激时可引起该细胞活化，导致α-SMA表达增多，加速合成细胞外基质（extracellular matrix，ECM）并促进肝纤维化。在肝脏损伤及炎症反应过程中，TGFβ1分泌增多导致HSC活化，活化的HSC数量增多又可使TGFβ1分泌增多，两者相互作用维持HSC进一步活化，最终导致肝脏纤维化。此外，大量的TGFβ1产生可激活ERK通路信号转导，导致NF-κB转位入核，发挥更强的炎症作用[12]。本研究发现T2DM大鼠肝组织出现NF-κB蛋白胞浆表达增强并出现个别细胞核转位，TGFβ1蛋白表达明显增强，HSC明显增生；经棉酚治疗后，NF-κB蛋白表达量减弱伴个别细胞核表达，TGFβ1蛋白表达及mRNA水平明显降低，HSC明显减少，提示棉酚一方面可能通过降低血糖使氧化应激作用减弱，间接抑制NF-κB、TGFβ1的表达，另一方面通过抑制肝NF-κB核转位、协同抑制TGFβ1蛋白表达，两者共同减弱HSC的激活，从而减少肝内胶原纤维的合成，改善肝纤维化病变。

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Effect of gossypol on hepatic fibrosis of nonalcoholic fatty liver disease in diabetic rats

LI Yangyang1,CHEN Hanbin2, XU Feifei1, WAN Li1, CHEN Guorong1, CHEN Lei3, CHEN Sanmei4, WANG Rongrong1.
1.Department of Pathology, the First Aff i liated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015; 2.Department of Radiation and Chemotherapy, the First Aff i liated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou,325015; 3.The First Clinical Medical College, Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325035; 4.Department of Nursing, School of Medical Sciences, Shaoxing University, Shaoxing, 312000

Objective： To investigate the effect of gossypol on nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) and its mechanism. Methods： Thirty male Sprague-Dawley rats were divided randomly into 3 groups： normal control(NC) group, type 2 diabetes mellitus (T2DM) group, type 2 diabetes mellitus treated with gossypol (T2DMG)group. After fed with a high-fat diet, the rats were injected with low-dose streptozotocin (STZ) intraperitoneally to induce type 2 diabetes mellitus. The T2DMG group were given 15 mg·kg-1·d-1gossypol by gavage for 4 weeks,followed by 15 mg·kg-1·d-1dose of gossypol every week for 8 weeks. The morphology of the liver was observed under light and transmission electronmicroscopy. Masson staining were used to observe the fi brosis of liver tissue.The protein expression of α-SMA, 11β-HSD1, GR, NF-κB and TGFβ1 were assayed by immunohistochemistry.The mRNA expression of 11β-HSD1, GR, NF-κB and TGFβ1 from rats livers were assayed by semi-quantitative RT-PCR. Results： Compare with NC group, T2DM group hapatic fi brosis was obvious, α-SMA, 11β-HSD1, GR,NF-κB and TGFβ1 protein expression was signif i cantly enhanced (P=0.001, 0.004, 0.001, 0.001, 0.002), GR and TGFβ1 mRNA expression was significantly increased (P=0.01, 0.001). Compare with T2DM group, T2DMG group liver fibrosis was significantly ameliorated, α-SMA, 11β-HSD1, GR, NF-κB and TGFβ1 expression was signif i cantly decreased (P=0.009, 0.031, 0.002, 0.009, 0.027), 11β-HSD1, GR and TGFβ1 mRNA expressionwas signi fi cantly reduced (P=0.003, 0.038, 0.014). Conclusion： Gossypol exerts the capacity to relieve hepatic fi brosis from NAFLD, inhibiting the expression of 11β-HSD1, GR and NF-κB, TGFβ1 may be involved in it.

liver fi brosis; diabetes mellitus; gossypol; 11β-hydroxysteroid dehydrogenase 1; glucocorticoid receptor; nuclear transcription factor-κB; transforming growth factor-β1

R363

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2017.11.002

2017-04-24

浙江省公益性技术应用研究计划项目（Y2011c23123）；温州市科技局科研基金资助项目（Y20120010，Y20130166）。

李秧秧（1986-），女，浙江温州人，住院医师。

王蓉蓉，副主任医师，Email：997683344@qq.com。

丁敏娇）