多重PCR技术检测儿童下呼吸道感染病毒和不典型病原体的价值

张海邻，陈小芳，吕芳芳，钟佩佩，陈波，徐智，董琳

（1.温州医科大学附属第二医院育英儿童医院 儿童呼吸科，浙江 温州 325027；2.宁波海尔施基因科技有限公司，浙江 宁波 315040）

多重PCR技术检测儿童下呼吸道感染病毒和不典型病原体的价值

张海邻1，陈小芳1，吕芳芳1，钟佩佩1，陈波2，徐智2，董琳1

（1.温州医科大学附属第二医院育英儿童医院 儿童呼吸科，浙江 温州 325027；2.宁波海尔施基因科技有限公司，浙江 宁波 315040）

目的：全面了解病毒和不典型病原体在儿童下呼吸道感染（LRTI）病原中的分布，探讨多重PCR技术检测呼吸道病原的临床应用价值。方法：收集2014年1月至2014年12月温州医科大学附属第二医院育英儿童医院992例因LRTI住院的5岁以下患儿的鼻咽分泌物，用直接免疫荧光法检测呼吸道合胞病毒、流感病毒A、流感病毒B、副流感病毒、腺病毒和衣原体抗原，并提取核酸，采用基于先进片段分析的多重PCR技术测定呼吸道合胞病毒、流感病毒A、流感病毒B、副流感病毒、腺病毒、鼻病毒、博卡病毒、偏肺病毒、冠状病毒和肺炎支原体、衣原体基因。结果：本组患者男662例，女330例，＜1岁组587例，1～3岁组287例，3～5岁组118例。多重PCR技术检测结果发现，851例患儿的鼻咽分泌物标本至少存在一种病原阳性（占85.8%），224份标本（占22.6%）检测到两种或两种以上病原。呼吸道合胞病毒和鼻病毒占所有检测病原的前两位。不同年龄组的病原阳性率分别为84.8%、89.2%和82.2%，组间差异无统计学意义（χ2=4.416，P=0.110）。但＜1岁组和1～3岁组的混合感染率均明显高于3～5岁组（χ2=3.963、9.871，P=0.047、0.002）。鼻病毒可见于各年龄段LRTI患儿，而呼吸道合胞病毒则主要见于婴幼儿。和直接免疫荧光法比较，相同病原检出的一致性较好（Kappa=0.615，p＜0.01），但PCR技术病毒的检出率更高（58.37% vs. 41.53%，χ2=56.23，p＜0.001）。结论：呼吸道合胞病毒和鼻病毒占本地区5岁以下儿童LRTI主要病毒和不典型病原的前两位，博卡病毒、冠状病毒和偏肺病毒亦可见，肺炎支原体少见；和直接免疫荧光法比较，多重PCR技术有助于全面了解儿童LRTI的病原。

下呼吸道感染；病原；病毒；多重聚合酶链反应；先进片段分析技术

儿童下呼吸道感染（lower respiratory tract infection，LRTI）临床多见，病毒是最常见的病原，包括流感病毒（influenza virus，Inf）A和B、呼吸道合胞病毒（respiratory sysyncytial virus，RSV）、副流感病毒（human parainfluenza virus，HPIV）、腺病毒（adenoviridae，ADV）、鼻病毒（human rhinovirus，HRV）等[1-2]，衣原体和支原体等不典型病原体也起着十分重要的作用[3]。目前普遍采用直接免疫荧光法（direct immunofluorescentassay，DFA）检测病毒和衣原体（chlamydia，Ch）抗原，虽有较高的特异度，但灵敏度不理想；肺炎支原体（mycoplasma pneumoniae，MP）多依赖抗体检测，而年幼儿童抗体产生能力较弱[4]，影响到LRTI的病原诊断。在普通PCR技术上发展起来的多重PCR技术可同时检测多种病原体，实现高通量、高灵敏度、高特异性检测，临床价值大[5]。本研究采用基于先进片段分析技术（advanced fragment analysis，AFA）的多重PCR技术检测9种呼吸道病毒和MP、Ch两种不典型病原体，更全面地了解病毒和不典型病原体在本地区儿童LRTI病原中的地位，探讨多重PCR技术的临床应用价值。

1 对象和方法

1.1 对象 选取2014年1月至2014年12月温州医科大学附属第二医院育英儿童医院因LRTI住院的5岁以下患儿。入选标准：①发病7 d之内；②临床诊断为支气管炎、肺炎和毛细支气管炎，诊断标准参考诸福棠实用儿科学第七版[6]。排除标准：①28日龄以内的新生儿；②鼻咽分泌物标本细胞数量过少或核酸提取含量不足；③临床资料不全者。本研究经温州医科大学附属第二医院育英儿童医院伦理委员会批准（批准号：2014-59），所有入选者家属均签署知情同意书。

1.2 呼吸道标本采集及处理 患儿入院24 h内，选取8号吸痰管通过鼻孔插入鼻咽部，将黏液收集器连接到另一端，一边吸一边缓慢退出，导管中的残余液体加入无菌0.9%氯化钠溶液冲洗至收集器中，每个鼻孔取鼻咽分泌物约0.5 mL共1 mL置于2 mL 0.9%氯化钠溶液中，将标本迅速送到临床实验室待检。用漩涡混合器打散黏液后，1 500 r/min离心10 min，取沉淀物用pH 7.2、0.01 mmol/L PBS 8～10 mL洗涤2次，再用1 mL PBS调成悬液呈淡云雾状，用于DFA法检测。采用TANBead®OptiPure Viral Auto Tube（台湾圆点奈米技术股份有限公司）对鼻咽分泌物标本的核酸进行自动磁珠提取，核酸提取后置PCR管中保存。

1.3 DFA法检测 鼻咽部分泌物离心沉淀制片，空气中自然干燥，冷丙酮固定10 min，取出完全挥发冷丙酮，采用荧光标记的呼吸道病毒单克隆抗体分别检测RSV、ADV、InfA、InfB、HPIV和Ch，其中HPIV包括1～3型。试剂盒由美国Chemicon公司生产，具体过程按试剂说明书操作，结果判断以见到≥2个完整细胞内有明亮的黄绿色荧光为阳性，否则为阴性。

1.4 多重PCR检测

1.4.1 检测的病原：除RSV、ADV、InfA、InfB、HPIV和Ch外，还包括HRV、博卡病毒（human bocavirus HBoV）、偏肺病毒（human metapneumovirus，HMPV）、冠状病毒（human coronavirus，HCoV）和MP。其中HPIV包括1～4型，冠状病毒包括OC43、229E、NL63和HKU1型，InfA则包括2009 H1N1（09H1）和H3N2（H3）。

1.4.2 引物设计：根据NCBI上公布的病原体目的序列，进行Blast比对分析，找到各个病原体的相对保守的区域并设计引物；本研究采用的11种呼吸道病原靶点及片段大小见表1；从中国食品药品检定研究院购买已知浓度的各病原体国家参考品，将国家参考品进行梯度稀释并用各引物进行检测，不能有效扩增时的病原体浓度为该位点的扩增灵敏度；收集其他呼吸道病原进行定量后进行检测，以确认本研究采用的引物不会对这些病原的核酸进行扩增，以确定特异度；最后将所有检测靶点的反向和正向引物分别混合成反转录引物混合液（RT primer mix）和PCR引物混合液（PCR primer mix）。

表1 11种病原的基因靶点及内参片段长度

1.4.3 RT-PCR扩增：按以下比例在PCR管内加入试剂和样品以进行目的片段的反转录步骤：DNase/RNase Free H2O 8 μL+5x RT Buffer 4 μL+RT primer mix 2 μL+Reverse transcriptase 1 μL+Sample 5 μL，合计20 μL，混匀后按以下温度孵育：48 ℃ 1 min、42 ℃ 60 min、95 ℃ 5 min，然后在4 ℃保存。之后按以下比例在新的PCR管内加入试剂和样品以进行目的片段的PCR步骤：10×PCR Buffer 2 μL+25 mmol/L MgCl24 μL+PCR primer mix 2 μL+Solution X 2 μL+Taq DNA Polymerase 0.7 μL+RT产物9.3 μL，合计20 μL，混匀后按以下温度进行热循环反应94 ℃ 1 min、94 ℃ 30 min、60 ℃ 30 min、70 ℃ 1 min，上述步骤重复35次，70 ℃ 1 min，然后在4 ℃保存。

1.4.4 毛细电泳片段分离：配制下述毛细电泳体系：上样液38.5 μL+DNA内标0.5 μL+PCR产物1 μL，合计40 μL，将约220 μL分离液加入96孔分离液板上对应的孔中。用遗传分析仪对各样品的PCR产物进行毛细电泳分离。

1.4.5 结果分析：每个样品的峰型图中三个内参的峰（人RNA、人DNA和反应内参）必须出现，说明样品未发生明显降解且实验流程正常；所有病原体的PCR产物片段长度需要与参考大小的差距小于1.5 bp。阴性和阳性质控品峰型见图1-2。

图1 阴性质控峰型

图2 阳性质控峰型

1.5 统计学处理方法 采用SPSS16.0软件进行统计学分析。计量资料作正态性检验和方差齐性检验，计数资料采用卡方检验，一致性采用Kappa检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料 2014年1月至2014年12月本院诊断LRTI的992例5岁以下患儿的鼻咽分泌物标本，男662例，女330例，男女比2∶1。＜1岁组587例，1～3岁组287例，3～5岁组118例，中位年龄10个月。诊断为支气管炎292例，毛细支气管炎403例，肺炎297例。

2.2 多重PCR呼吸道病毒检原结果 992例患儿中，851例患儿的鼻咽分泌物标本至少存在一种病原阳性（占85.8%），224份标本（占22.6%）检测到两种或两种以上病原。RSV和HRV占所有检测病原的前两位，检测到的病原体按例数分别为：RSV 302例（占30.44%），HRV297例（占29.94%），HPIV 145例（占14.62%），ADV 91例（占9.17），InfA 65例（占6.55%，其中09H1 39例，H3N2 26例），HBoV 52例（占5.24%），MP 49例（占4.94%），HCoV 33例（占3.33%），HMPV 31例（占3.13%），InfB 26例（占2.62%），Ch 16例（占1.61%）。

男性患儿的检测阳性率为87.0%（576/662），女性患儿的检测阳性率为83.3%（275/330），两者差异无统计学意义（χ2=2.440，P=0.118）。不同年龄组LRTI病原检测结果显示，3组的病原阳性率分别为84.8%，89.2%和82.2%，组间差异无统计学意义（χ2=4.416，P=0.110）。但＜1岁组和1～3岁组的混合感染率均高于3～5岁组，差异有统计学意义（χ2=3.963、9.871，P=0.047、0.002），见表2。HRV可见于各年龄段LRTI患儿，分别占各组的28.11%、35.89%和24.58%，而RSV则主要见于婴幼儿，＜1岁组和1～3岁组分别占34.75%和29.97%，而3～5岁组仅占10.17%（见表3）。

表2 不同年龄组患儿呼吸道病毒和不典型病原的检出情况[ n（%）]

表3 不同年龄组各病原的检出情况[ n（%）]

2014年1～12月不同病原的分布结果显示，夏季和冬季是病毒的好发季节，其中HRV和RSV可见于各月份，而HPIV则在5～8月多见。此外，2014年1月，本地区有流行性09H1病毒感染的小高峰，见图3。

图3 2014年1～12月不同病原的分布情况

2.3 多重PCR和直接免疫荧光检测检结果比较 鉴于直接免疫荧光法仅能检测RSV、ADV、InfA、InfB型，HPIV等5种病毒和Ch抗原，我们选取同样6种病原的PCR检测结果，两者一致性较好（Kappa=0.615，P＜0.01），见表4。但多重PCR法阳性率高于DFA法（58.37%vs.41.53%，χ2=56.23，P＜0.001）。2种检测方法均为阳性的390例标本中，342例的检测结果完全一致，另有48例中，一种病原结果一致，但多重PCR法还检出DFA法未检出的其他病原。

表4 多重PCR和DFA法检测6种呼吸道病原一致性比较（n）

3 讨论

病毒是婴幼儿LRTI的重要病原，其中RSV是引起儿童LRTI的最常见病毒，多见于婴幼儿，尤其是1岁以内小儿，容易引起毛细支气管炎和肺炎，HPIV也是婴幼儿期间呼吸道感染的重要病毒病原，在急性呼吸道感染住院儿童中HPIV感染占9%～30%[7]。长期以来，临床均采用DFA法检测呼吸道病毒，其中美国Chemicon公司的呼吸道病毒检测试剂盒仅能检测RSV、ADV、InfA、Inf B、HPIV等5种病毒。我们既往采用DFA法检测发现，RSV和HPIV是本地区儿童LRTI最常见的病毒病原前两位[8]。本研究采用多重PCR技术则发现，992例患儿中，851例患儿的鼻咽分泌物标本至少存在一种病原阳性，占85.8%，且不同年龄组的检出率相仿，其中病毒占所有检出病原的93.45%，提示病毒仍是本地区儿童LRTI的主要病原。RSV（占30.44%）是首位病毒病原，多见于3岁以下儿童。HRV占29.94%，居病毒病原的第二位，且可见于各个年龄段，提示HRV在本地区儿童LRTI病原中的重要性长期未得到重视。目前认为，HRV不仅是人类普通感冒的最主要病毒，也是引起婴儿及儿童LRTI的主要病原之一[9]，还在早产儿LRTI中起着重要作用[10]，应引起临床医师的高度重视。

本研究发现，本地区儿童LRTI中HBoV、HCoV、HMPV等病毒检出率分别占5.24%、3.33%和3.13%，这些病毒在呼吸道感染中的作用已陆续被报道，但采用DFA法却无法检出。本研究采用多重PCR技术还能检测MP和Ch两种不典型病原体，发现本组仅有49例（占4.94%）标本检出MP，且在3～5岁组检出率相对较高（占14.41%），提示MP并不是本地区5岁以下儿童LRTI的主要病原。此外，病毒感染往往合并存在，本组资料显示224份标本（占22.6%，224/992）检测到两种或两种以上病原，和文献报道相似[1，11]。尽管众多学者对混合感染能否加重感染程度有争议，但普遍认为，混合感染的流行病学特点和临床特征与单一感染有所不同[12]。我们对2014年1～12月不同病原的分布情况做进一步分析，发现夏季和冬季仍是病毒感染的好发季节，其中HPIV在5～8月多见，而HRV和RSV可见于各月份。此外，在检测到的65例InfA中，39例09H1多见于2014年1月，提示当时本地区有流行性H1N1 2009病毒感染的小高峰，而26例H3N2则散发在各个月份。因此，多病原联合检测不仅能全面了解儿童LRTI的病原特点，还有助于我们进一步发现混合感染，检测流感的流行状况。

如何早期准确诊断LRTI病原学一直是临床面临的难点，建立一种快速、有效、高通量且能同时检测多种呼吸道病原的检测技术有很大的临床价值。目前国内外常见的呼吸道病原诊断技术主要有直接电镜观察法、免疫学检测技术及核酸检测技术等。在普通PCR技术上发展起来的多重PCR技术可同时检测多种病原体，不仅省时省力，节约单个病原体的检测成本，还可以提高样本的使用率。Luminex公司的xTAG呼吸道病毒检测试剂盒于2008年1月被美国FDA批准在美国上市，之后进入我国，是目前唯一在我国上市的基于多重PCR技术的呼吸道病毒检测试剂盒，但是该试剂盒仅能检测呼吸道病毒，不能检测MP和Ch，且该方法对仪器要求较高，不利于试剂盒在我国的推广使用。

AFA是一种集合RT-PCR法及毛细电泳法的技术，可以在一个管子内同时分析大量的基因，技术简单、高效、价格低廉，已被用于病原学、白血病基因等检测[13-14]。我们以常见的9种呼吸道病毒和2种不典型病原体的高度保守序列为靶区域，设计了11组特异性引物，在一个扩增管中进行一步法RT-PCR扩增；采用毛细电泳分离不同长度的扩增产物、得到病原体的检测结果；通过对样品中的人RNA和人DNA进行检测，对样品质量进行监控；同时利用RT-PCR内参用于对核酸提取、RT-PCR和毛细电泳等整个检测过程进行监控。本研究进一步证实了基于AFA的多重PCR技术在儿童LRTI病原诊断中的临床价值，和临床常用的DFA法检测抗原比较，不仅能检测出HRV、HBoV、HCoV、HMPV等病毒，还能检测MP和CP，并能增加混合感染的检出率。

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Detection of viral and atypical pathogens in children with lower respiratory tract infection by multiple PCR techniq

ZHANG Hailin1, CHEN Xiaofang1, LYU Fangfang1, ZHONG Peipei1, CHEN Bo2, XU Zhi2,DONG Lin1.
1.Department of Pediatric Pulmonology, the Second Aff i liated Hospital & Yuying Children’s Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325027; 2.Ningbo Health Gene Technologies Co., Ltd., Ningbo,315040

Objective： To understand the distribution of viruses and atypical pathogens in children’s lower respiratory tract infections (LRTI), and to investigate the clinical value of multiplex PCR technique. Methods：Nasopharyngeal secretions of 992 children under 5 years old who were hospitalized for LRTI in the Second Affiliated Hospital & Yuying Children’s Hospital of Wenzhou Medical University were collected, from January 2014 to December 2014. Direct immunof l uorescence assay was used to detect respiratory syncytial virus (RSV),inf l uenza virus A, inf l uenza virus B, parainf l uenza virus, adenovirus and Chlamydia antigen, and extract nucleic acid. Use multiple PCR method based on advanced fragment analysis to detect RSV, inf l uenza A virus, inf l uenza virus B, parainf l uenza virus, adenovirus, human rhinovirus (HRV), bocavirus, human metapneumovirus, coronavirus, mycoplasma pneumonia and Chlamydia gene. Results： There were 662 males and 330 females, 587 were in ＜1 year old group, 287 were in 1-3 years old group, 118 were in 3-5 years old group, the median age was 10 month. By using multiple PCR method, nasopharyngeal secretions from 851 patients were detected at least one pathogen (85.8%), 224 detected two or more than two pathogens (22.6%). RSV and HRV accounted for the top two of all detected pathogens, and the positive rates of pathogens in different groups were 84.8%, 89.2% and82.2%, there was no signi fi cant difference between the three groups (χ2=4.416, P=0.110). However, the mixed infection rates in ＜1 year old group and 1-3 year old group were signi fi cantly higher than 3-5 year old group(χ2=3.963 and 9.871, P=0.047 and 0.002). As for LRTI children, HRV can be detected of all ages, while RSV is mainly in infants. Compared with immuno fl uorescence, the consistency of the same pathogen detection is good(Kappa=0.615,p＜0.01), but multiple PCR method was better for detecting other pathogens (58.37% vs. 41.53%,χ2=56.23,p＜0.001). Conclusion： RSV and HRV are the fi rst two of the major virus and atypical pathogens of LRTI in children under 5 years old in this region. Bocavirus, coronavirus, and human metapneumovirus can also be detected, mycoplasma was rare. Compared with the direct immuno fl uorescence method, multiple PCR is helpful in comprehensive understanding the etiology of LRTI in children.

lower respiratory tract infections; noxae; virus; multiple polymerase chain reaction; advanced fragment analysis

R725.6

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2017.11.003

2017-03-08

浙江省科技厅分析测试项目（2015C37026）。

张海邻（1971-），男，浙江慈溪人，主任医师。

贾建敏）