高效液相色谱法同时测定棉籽油中游离棉酚及其降解产物四甲氧基棉酚含量

周梦宇，古丽斯坦·阿不来提，姚 军*，陈 玲

（新疆医科大学药学院，新疆 乌鲁木齐 830011）

新疆地区是我国优质的棉产区，棉花副产物之一的棉籽大部分用于榨油，并且棉籽油含有较高的不饱和脂肪酸[1-2]，可有效降低胆固醇和预防心脑血管疾病[3-4]。棉酚作为棉籽中提取的小分子化合物，是一种黄色多酚羟基双萘醛类化合物，在棉籽中含量高达0.15%～1.8%[5]。棉酚包含游离棉酚和结合棉酚两种存在方式，其中结合棉酚是通过游离棉酚与赖氨酸中游离ε-氨基之间的共价键经褐变反应结合产生的，通常毒性较小[6]；而高浓度的游离棉酚会引起动物急性中毒，并伴有呼吸窘迫，厌食虚弱，甚至死亡等症状[7-9]，摄食游离棉酚1～3 个月后会造成毒性作用的积累效应[10-12]，有明显的生殖毒性[13-16]，因此长期食用含有游离棉酚的棉籽油会引起慢性中毒[17]。游离棉酚由于结构中具有多个酚羟基及醛基，化学性质非常不稳定[18-19]，棉籽油中游离棉酚在室温下放置30 d，80%的棉酚会发生降解[20]，在放置过程中，游离棉酚酚羟基中的H易发生甲基化反应（结构变化见图1），根据本课题组研究发现证实游离棉酚在棉籽油中降解产物为四甲氧基棉酚[21]，并发现四甲氧基棉酚能够对小鼠GC-2精母细胞造成生长抑制等毒性作用并导致细胞死亡[22]，造成雄性小鼠精子发生畸形变化，表明四甲氧基棉酚存在一定生殖毒性[23]；对SD大鼠灌服四甲氧基棉酚30 d后结果发现大鼠肝脏组织的形态结构改变，造成肝损伤，证实了四甲氧基棉酚的毒性作用[24]。

图1 游离棉酚与四甲氧基棉酚结构变化图Fig. 1 Structural changes of free gossypol relative to tetramethoxy gossypol

目前食用粗制棉籽油中毒的现象仍然存在[25]，而市售棉籽油中生产加工过程及随着存放时间和环境的改变，游离棉酚及降解产物四甲氧基棉酚的存在是危害消费者健康的重要因素。GB 2716—2005《食用植物油卫生标准》[26]中规定食用植物油中棉籽油游离棉酚含量不得超过0.02%，然而对其降解产物四甲氧基棉酚的含量未作出规定，因而急需建立含量测定方法，因此本实验建立了同时测定棉籽油中游离棉酚及其降解产物四甲氧基棉酚含量的高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法，并进行方法学考察，旨在建立更加科学的棉籽油质量控制方法，防止游离棉酚及四甲氧基棉酚含量不合格的食用棉籽油进入市场，对人民身体健康的保障起到积极作用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

棉酚标准品（纯度98%）购自陕西慈源生物科技有限公司；四甲氧基棉酚工作标样（纯度85.30%）为课题组经ODS柱层析分离得到；实验所检测的1#～90#批市售棉籽油样品来自新疆各地州大型油脂企业。

冰醋酸（分析纯） 天津博迪化工股份有限公司；95%乙醇（分析纯） 天津市凯通化学试剂有限公司；甲醇（色谱纯） 美国Fisher公司；磷酸（优级纯）成都市科龙化工试剂厂。

1.2 仪器与设备

TB-114型分析天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司；TDL-5A型离心机 上海菲恰尔分析仪器有限公司；MS3BS25型涡旋振荡器 德国IKA公司；1220型高效液相色谱仪 美国安捷伦公司。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件

色谱柱为Inertsil®ODS-3（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相甲醇-2%磷酸（85∶15，V/V）溶液，进样量10 mL，流速1.0 mL/min，柱温32 ℃，检测波长235 nm。

1.3.2 标准品溶液的制备

分别称取6.13 mg棉酚标准品与10.56 mg四甲氧基棉酚工作标样于25 mL容量瓶中，加入0.5 mL冰醋酸溶液，95%乙醇溶液溶解并定容至刻度，即为棉酚（0.245 mg/mL）及四甲氧基棉酚（0.422 mg/mL）的标准品溶液。精密吸取各1 mL标准品溶液，用95%乙醇溶液定容至100 mL容量瓶中，得质量浓度为2.452 mg/mL的棉酚和4.224 mg/mL的四甲氧基棉酚混合标准品溶液。

1.3.3 供试品溶液的制备

精密量取市售油样2 mL，加入95%乙醇溶液2 mL，剧烈振摇2 min后静置分层，4 000 r/min离心5 min，吸取上清液即得含油样的供试品溶液。

1.4 数据处理

各实验至少重复3 次以上，使用CDS、Excel等软件进行图表的绘制和相关数据的统计处理。

2 结果与分析

2.1 棉酚及四甲氧基棉酚标准曲线的建立

精密吸取混合储备液各0.5、1、1.5、2、2.5 mL置于10 mL棕色容量瓶中，用95%乙醇溶液定容，考察四甲氧基棉酚线性关系；精密吸取混合标准品溶液各1、2、3、4、5 mL置于10 mL棕色容量瓶中，用95%乙醇溶液定容，考察棉酚线性关系。各样品经0.22 mm微孔滤膜过滤，按1.3.1节色谱条件进样测定，记录峰面积，HPLC见图2。结果表明四甲氧基棉酚在0.211～1.056 mg/mL质量浓度范围内线性关系良好，得线性回归方程为：Y=2 205 265.15X－135 755.00，r=0.999 6；棉酚在0.245～1.226 mg/mL质量浓度范围内线性关系良好，得线性回归方程为：Y=1 809 717.37X－258 173.90，r=0.999 5。

图2 四甲氧基棉酚（A）和棉酚（B）标准品HPLC图Fig. 2 HPLC chromatogram of tetramethoxy gossypol (A) and gossypol (B) standards

2.2 精密度实验

取经稀释的同一份混合标准品溶液（棉酚质量浓度为0.736 mg/mL，四甲氧基棉酚质量浓度为0.636 mg/mL），经0.22 mm微孔滤膜过滤，按1.3.1节色谱条件进样测定，连续进样6 次，测得四甲氧基棉酚峰面积值为1 280 614、1 294 758、1 308 224、1 259 180、1 315 379、1 289 456 ，计算得相对标准偏差为1.56%；测得棉酚峰面积值为1 105 268、1 080 236、1 095 491、1 102 300、1 090 330、1 103 457，计算得相对标准偏差为0.88%，表明该方法精密度良好。

2.3 重复性实验

精密量取同一批含有四甲氧基棉酚及棉酚的棉籽油样品6 份于离心试管中，按1.3.3节方法操作，经0.22 mm微孔滤膜过滤，按1.3.1节色谱条件进样检测，测得四甲氧基棉酚峰面积值为1 489 375、1 493 646、1 505 442、1 486 409、1 458 576、1 472 375，计算得相对标准偏差为1.11%；测得棉酚峰面积值为1 330 995、1 277 432、1 308 919、1 298 049、1 329 467、1 283 157，计算得相对标准偏差为1.73%，表明该方法的重复性良好。

2.4 稳定性实验

取同一批含有四甲氧基棉酚及棉酚的棉籽油样品于离心试管中，按1.3.3节方法操作，在4 ℃放置0、2、4、6、8、10，12 h，经0.22 mm微孔滤膜过滤，按1.3.1节色谱条件进样检测，测得四甲氧基棉酚峰面积值为2 507 353、2 492 601、2 472 286、2 488 623、2 600 460、2 519 553，计算得相对标准偏差为1.81%；测得棉酚峰面积为1 583 502、1 638 809、1 553 259、1 576 115、1 608 310、1 596 012，计算得相对标准偏差为1.65%，表明棉籽油样品中四甲氧棉酚及棉酚在12 h内稳定性良好。

2.5 加样回收率实验

吸取同一批含有四甲氧基棉酚（0.562 mg/mL）及棉酚（0.719 mg/mL）的棉籽油样9 份各0.50 mL，3 份为一组，取四甲氧基棉酚质量浓度为0.636 mg/mL和棉酚质量浓度为0.837 mg/mL的混合标准品溶液分别加入0.35、0.45、0.55 mL，按1.3.3节方法操作，经0.22 mm微孔滤膜过滤，按1.3.1节色谱条件进样检测，四甲氧基棉酚平均回收率100.3%，相对标准偏差为1.12%；棉酚平均回收率为101.2%，相对标准偏差为1.75%（表1、2）。

表1 四甲氧基棉酚加样回收率Table 1 Recoveries of tetramethoxy gossypol from spiked sample

表2 棉酚加样回收率Table 2 Recoveries of gossypol from spiked sample

2.6 市售棉籽油四甲氧基棉酚及棉酚含量测定

1#～90#市售棉籽油样品均按1.3.3节方法操作，按1.3.1节色谱条件进样检测。研究表明，90 批市售棉籽油有25 批检测到棉酚，质量浓度为0.159～1.661 mg/mL，有56 批检测到四甲氧基棉酚，质量浓度为0.093～1.661 mg/mL，结果见表3，市售棉籽油样品与混合标准品溶液的HPLC对比图见图3。

表3 市售棉籽油样品中四甲氧基棉酚及棉酚质量浓度Table 3 Contents of tetramethoxy gossypol and gossypol in commercially available cottonseed oil samples

续表3

图3 混合标准品（A）与市售棉籽油（B）HPLC图Fig. 3 HPLC chromatograms of mixed reference substance (A) and commercially available cottonseed oil (B)

3 结论与讨论

本研究使用的四甲氧基棉酚工作标样，是课题组经ODS柱分离纯化自制未脱毒棉籽油中的游离棉酚降解产物，采用HPLC检测，根据面积归一化法，得纯度为85.30%的四甲氧基棉酚[24]，因未达到标准品纯度范围标准，所以仅作为工作标样来进行研究考察。目前对于游离棉酚的检测方法有很多，包括分光光度法[27]、高效薄层色谱法[28]、高效毛细管电泳法[29]、HPLC法[30]等。本实验建立了HPLC法同时测定棉籽油中游离棉酚及降解产物四甲氧基棉酚含量的方法，该方法准确度高，精密度和灵敏度均能满足测定要求，可以监管棉籽油生产企业的脱毒工艺，为棉籽油中游离棉酚及其降解产物四甲氧基棉酚的检测标准奠定基础，同时制止游离棉酚及降解产物含量超标的棉籽油进入市场，为本地区食品安全问题提供重要依据。

通过对新疆各地区市售棉籽油进行抽查，结果发现90 批市售棉籽油中有25 批检测到游离棉酚，56 批检测到四甲氧基棉酚，根据GB 2716—2005《食用植物油卫生标准》，检测到市售棉籽油中游离棉酚及降解产物四甲氧基棉酚含量较低，且均低于国家标准，可能不足以对消费者的健康造成威胁，表明所检测的新疆各地大型油脂企业棉籽油样品，脱毒较完全，安全性较高。课题组后期将对新疆各地榨油小作坊的棉籽油样品进行实地采集及检测，用于更加全面地评价新疆市售棉籽油的脱毒情况及安全性。