苍菊清肝降脂方对蛋氨酸-胆碱缺乏诱导小鼠脂肪性肝炎的防护作用*

明利平 平键 成扬,△ 胡晓凤 周向杰 蔡顾庆

1.上海浦东新区传染病医院 (上海， 201299) 2.上海中医药大学附属曙光医院

苍菊清肝降脂方对蛋氨酸-胆碱缺乏诱导小鼠脂肪性肝炎的防护作用*

明利平1平键2成扬1,2△胡晓凤1周向杰1蔡顾庆1

1.上海浦东新区传染病医院 (上海， 201299) 2.上海中医药大学附属曙光医院

目的：观察苍菊清肝降脂方对蛋氨酸-胆碱缺乏(MCD)诱导的小鼠脂肪性肝炎的防护作用。方法C57BL/6小鼠60只，雌雄各半，随机分为对照组、模型组、苍菊清肝降脂方(苍菊方)高中低剂量组和多稀磷脂酰胆碱组，对照组小鼠给予蛋氨酸-胆碱充足(MCS)饲料，其他各组小鼠予MCD饲料，自由进食。对照组和模型组灌胃饮用水，其余各组分别灌胃相应治疗药物。2w末，采集小鼠血清、肝组织标本，检测血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、肝组织甘油三酯(TG)含量，观察肝组织HE染色及油红O染色。结果与对照组小鼠比较，模型组小鼠ALT、AST、TG水平显著升高，经苍菊方干预的各组小鼠ALT、AST、TG水平均显著下降，且呈剂量依赖方式，其中高剂量苍菊方治疗疗效与多烯磷脂酰碱疗效组相近。模型组小鼠肝组织HE染色可见大量大泡性脂肪，肝细胞呈气球样变，油红O染色可见大量大小不等红色脂滴，部分融合成片，经用药干预，各组小鼠肝组织脂肪变性和肝脏炎症均明显改善。结论苍菊清肝降脂方可明显改善MCD饮食诱导的脂肪性肝炎肝损伤程度。

苍菊清肝降脂方；非酒精性脂肪性肝炎；小鼠；防护作用

苍菊清肝降脂方是上海市浦东新区传染病医院用于脂肪肝治疗的协定复方，前期研究已证实，该方对四氯化碳诱导的脂肪肝具有良好的干预作用[1,2]，本研究采用蛋氨酸-胆碱缺乏(MCD)饲料诱导小鼠脂肪性肝炎，观察该方的干预作用，为临床应用进一步提供实验依据。

1.材料与方法

1.1 实验动物 C57BL/6小鼠60只，雌雄各半，19±0.74g，购自上海斯莱克实验动物有限公司，饲养于上海中医药大学实验动物中心。

1.2 饲料 蛋氨酸-胆碱缺乏(MCD)饲料(配方：L-氨基酸176 g/kg、蔗糖442 g/kg、玉蜀黍淀粉150g/kg、右旋麦芽糖50g/kg、纤维素30g/kg、玉米油l00g/kg、碳酸氢钠7.4g/kg、盐混合物35g/kg、维生素混合物l0g/kg)和蛋氨酸-胆碱充足(MCS)饲料(配方是在MCD饮食配方基础上加胆碱2g/kg)由江苏南通特洛菲有限公司提供，4℃低温保存。

1.3 药物 ①苍菊清肝降脂方(简称苍菊方)，由苍术、炒白术、荷叶、决明子、菊花、蒲黄、五味子等组成，均采用江阴天江药业有限公司中药免煎颗粒，按原方比例溶解备用。②对照药物为多烯磷脂酰胆碱胶囊(赛诺菲安万特北京制药有限公司)。1.4 其他试剂及主要设备 二甲苯、甲醛、无水乙醇，为分析纯；中性树胶，均购自中国医药集团上海化学试剂公司。苏木素伊红染料，油红O染液，血清ALT、AST，肝组织TG检测试剂盒，均购自南京建成生物制品研究所。轮转切片机(RM2035)、冰冻切片机(CM1850)、烤片机、自动脱水机(LEICAASP300)、石蜡包埋机(LEICA EG1160)，均为德国Leica公司产品。光学显微镜(Olympus BX40)，日本Olympus公司。连续波长酶标仪酶标仪，美国BIO-TEK公司。

1.5 分组及给药 小鼠适应性饲养5天后，按完全随机方法随机分为6组，对照组、模型组、苍菊方高、中、低剂量组及多烯磷脂酰胆碱组，每组10只，雌雄各半。对照组小鼠喂饲MCS饲料模型及用药各组喂饲MCD饲料，共2周。造模同时，苍菊方高、中、低剂量组小鼠分别灌胃人体剂量，18、9、4.5倍苍菊方药液，多烯磷脂酰胆碱组小鼠灌胃按照人体剂量9倍灌胃，对照组和模型组小鼠灌胃等量双蒸水。

1.6 标本收集及指标检测 2w末，小鼠禁食12h后，称体重、麻醉、摘眼球取血，取血后静置2h，4℃，4000rpm，离心10 min，取上层血清备用。肝脏称取重量后，取右叶0.5cm×0.5cm大小组织两块，于10%中性甲醛溶液中固定备用甲醛固定的肝组织于24h后逐级酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，4μm切片，经脱蜡、脱水后行HE 染色，冰冻肝组织，7μm切片，行油红O染色。血清ALT、AST水平、肝组织TG含量，参照试剂盒说明书进行。

2.结果

2.1 各组小鼠体质量及肝指数情况 见表1。

表1 各组小鼠体质量及肝指数比较

2.2 各组小鼠血清ALT、AST及肝组织TG检测情况 见表2。

表2 各组小鼠血清ALT、AST及肝组织TG含量

与对照组比较，*P<0.01；与模型组比较，#P<0.05

2.3 小鼠肝脏病理形态学观察情况 肝组织HE染色观察可见：模型组小鼠肝脏组织可见广泛的大泡性脂肪变性，肝细胞可见气球样变，伴炎性细胞浸润；苍菊方用药各组小鼠肝脏组织脂肪变性主要成小泡状，肝细胞气球样变减轻；多烯磷脂酰胆碱组小鼠肝组织病理明显改善(见插页图1)。

油红染色，可见：对照组有少量油红着色；模型组小鼠肝组织可见大量大小不等的红色脂滴，部分有融合成片；药物干预组红色脂滴减小减少，其中多烯磷脂酰胆碱组小鼠肝组织改善最为明显(见插页图2)。

3.讨论

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)在全球范围都是一种发病率较高的疾病，肥胖、2型糖尿病、高脂血症均是NAFLD的主要危险因素。非酒精性脂肪性肝炎(NASH)是在NAFLD基础上演变而来，其特征是在没有过量饮酒的情况下，以肝实质细胞脂肪变性以及脂肪堆积为特征，伴随弥漫性肝小叶轻度炎症，甚至在肝中央静脉、肝窦间隙发生胶原沉积的临床综合征[3]。据文献报道，约15%～20%的NASH患者可以在10～20年内可进展为肝硬化[4]，随着乙肝疫苗的广泛应用以及抗病毒药的发展，慢性病毒性肝炎引起的肝纤维化将逐步减少，NAFLD在未来可能成为慢性肝病的重要原因，有必要引起足够的重视。NASH的发病机制较为复杂，除了其遗传易感性与多元代谢紊乱的相互作用的主要因素外，还与胰岛素抵抗、氧应激及脂质过氧化损伤、炎症细胞因子、线粒体功能障碍、细胞凋亡及自噬等等诸多因素相关[5]。

NASH是肝内以甘油三酯为主的脂肪蓄积过多为特点，实验研究中为了使动物模型肝脏达到这一病理特点，目前国内外研究人员广泛采用的方法包括高脂饮食、四氯化碳、MCD等。不同的造模方法各有特点，其中高脂饮食诱导的脂肪肝是通过饮食过量的脂质，最终导致脂肪在肝脏的过度堆积，该模型可模拟人类的发病过程及机制，能够复制胰岛素抵抗、氧化应激等人类全身代谢紊乱表现，在NASH研究领域更占优势，但是实验周期较长，而且动物进食量较难控制，对造模时间有一定影响[6]。MCD饮食诱导的脂肪肝的原理在于蛋氨酸与胆碱的缺乏诱发线粒体β-氧化功能障碍和极低密度脂蛋白合成分泌减少，从而导致甘油三酯在肝脏的过度堆积，进而肝细胞脂肪变性，最终诱发NASH，尽管该模型不符合患者的饮食结构，但是其造模时间短，成模率高，组织病理学改变典型，是公认的NASH造模方法[6，7]。因此本研究采用MCD方法，2w即可见肝组织明显的脂肪变性，肝细胞气球样变，血清转氨酶水平和肝组织TG含量均显著升高，符合该模型特点。

根据脂肪肝的临床表现，祖国医学主要将其归属为“肝癖”、“肥气”、“胁痛”等病名，病位在肝、脾、肾，发病机制为肝失疏泄，脾失健运，湿热内蕴，痰浊内结，瘀血阻滞，而最终形成痰瘀互结，痹阻于肝脏脉络而发病，治疗上多辨病与辩证相结合[8]。苍菊清肝降脂方是本单位在长期临床实践中不断摸索总结用于治疗脂肪性肝病的协定方，方中苍白术可燥湿健脾、扶正固本；决明子润肠通便、降脂；菊花清热平肝明目；荷叶、蒲黄散瘀祛湿；五味子收敛固涩。全方有散有收，共奏疏肝理气，健脾消脂之功。前期研究显示该方可以有效减轻四氯化碳联合高脂低蛋白饮食诱导的大鼠脂肪肝模型肝组织损伤和脂肪变性，减轻肝脏脂肪沉积，并显著改善氧化应激和脂质过氧化[1,2]，为了进一步验证该方防治脂肪肝作用，本文采用MCD诱导NASH小鼠模型，发现该方可明显降低血清ALT、AST水平，减少肝组织TG含量，改善肝组织病理脂肪变性和脂肪堆积，且呈现剂量依赖性，其中高剂量苍菊方疗效与多烯磷脂酰胆碱相近，提示该方可有效治疗MCD脂肪性肝炎，为该复方的临床应用提供了又一个实验依据。

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[2] 龚亚华, 张银华, 成扬, 等. 苍菊清肝降脂方对脂肪肝大鼠肝组织脂肪沉积、氧化应激和脂质过氧化的影响[J]. 中国中西医结合消化杂志. 2016， 24(08): 578-581.

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[4] Greenfield V, Cheung O, Sanyal AJ. Recent advances in nonalcholic fatty liver disease[J]. Curr Opin Gastroenterol, 2008， 24(3): 320-327.

[5] 黄颖秋. 非酒精性脂肪性肝炎发病机制的研究进展[J]. 世界华人消化杂志, 2009， 17(31): 3181-3188.

[6] 续畅, 刘泽洲, 许可嘉, 等. 高脂及MCD饮食诱导非酒精性脂肪性肝炎动物模型的比较[J]. 现代生物医学进展， 2014， 14(18): 3451-3455.

[7] Gyamfi MA, Damjanov I, French S,etal. The pathogenesis of ethanol versus methionine and choline deficient diet-induced liver injury[J]. Biochem Pharmacol， 2008， 75(4): 981-995.

[8] 牛逍遥, 赵文霞. 非酒精性脂肪性肝病中医研究进展[J]. 中医研究， 2016， 29(1): 75-78.

ProtectiveeffectofCangjuQingganJiangzhidecoctiononnonalcoholicsteatohepatitisinducedbymethioninecholinedeficientdietinmice

MINGLi-ping1,PINGJian2,CHENGYang1,2,etal.1.ShanghaiInfectiousDiseaseHospitalofPudongDistrict(Shanghai, 201299)China

ObjectiveTo observe the protective effect of Cangju qinggan jiangzhi decoction on nonalcoholic steatohepatitis induced by methionine choline deficient (MCD) diet in mice.MethodsSixty C57BL-6 mice, male and female, were randomly divided into control group, model group, Cangju qinggan jiangzhi deccoction groups (high and low dose group) and Essentiale group. the control group were given sufficient methionine choline (MCS) diet, other groups were given MCD diet, free food. At the same time, the control group and the model group were given water,other groups were given corresponding drugs respectively . At the end of 2 week, blood were collected through eyeball enucleation and mice were killed by cervical dislocation. Serum alanine aminotransferase (ALT) , aspartate aminotransferase (AST) and hepatic triglyceride (TG) content in liver tissue were detected and pathological changes were observed by HE staining and oil red O staining.ResultsCompared with the control group, ALT, AST, TG in the model group increased significantly.And Cangju qinggan jiangzhi decoction intervention groups were significantly decreased in a dose-dependent manner, Essentiale group improved the best effect. The model group HE staining of liver tissue mass bullous fat, liver cells showed ballooning, oil red O staining showed red lipid droplet sizes, some confluence, drug intervention group, hepatic steatosis and inflammation of the liver were significantly improved.ConclusionCangju qinggan jiangzhi decoction can significantly improve the degree of fatty hepatitis and liver injury induced by the MCD diet.

Cangjuqinggan jiangzhi decoction； nonalcoholic stepatohepatitis； mice, protective effect

10.3969/j.issn.1005-0264.2017.04.0014

上海市浦东新区科技发展基金创新资金医疗卫士项目(No.PKJ2015-Y20)，上海市浦东新区卫生系统领先人才项目 (No.PWRL2016-01)；△通讯作者

2017-3-31 编辑：肖明中)