RP-HPLC法同时测定枫蓼肠胃康胶囊中4种黄酮苷成分的含量

卢琴，李杰

(1.湖北省中西医结合医院，湖北 武汉 430015；2.湖北中医药大学，湖北 武汉 430065)

·中药工业·

RP-HPLC法同时测定枫蓼肠胃康胶囊中4种黄酮苷成分的含量

卢琴1*，李杰2

(1.湖北省中西医结合医院，湖北 武汉 430015；2.湖北中医药大学，湖北 武汉 430065)

目的建立反相高效液相色谱法同时测定枫蓼肠胃康胶囊中芦丁、金丝桃苷、槲皮苷、山奈酚-3-O-芸香糖苷含量的方法。方法采用Waters X bridge C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱；流动相系统：乙腈(A)-0.2%甲酸水溶液(B)，梯度洗脱；流速：1.0 mL·min-1；柱温：25 ℃；检测波长：350 nm。结果芦丁、金丝桃苷、槲皮苷、山奈酚-3-O-芸香糖苷的质量浓度分别在12.42～310.50、5.95～148.75、6.85～171.25、7.88～197.00 μg·mL与色谱峰面积呈良好的线性关系，加样回收率分别为98.6%、104.2%、104.5%、101.0%(n=6)，RSD分别为1.3%、1.1%、1.3%、1.6%。结论本方法符合方法学验证要求，简便、快捷，可用于枫蓼肠胃康胶囊中4种黄酮苷成分的同时测定。

枫蓼肠胃康胶囊；芦丁；金丝桃苷；槲皮苷；山奈酚-3-O-芸香糖苷

枫蓼肠胃康胶囊是由牛耳枫、辣蓼2味药组方加工制成的中药复方制剂，具有清热、除湿、化滞的功能，用于急性胃肠炎属于伤食泄泻型及湿热泄泻型者，症见腹痛腹满、泄泻臭秽、恶心呕腐或有发热恶寒、苔黄、脉数等疾病，亦可用于食滞胃痛而症见胃脘痛、拒按、恶食欲吐、嗳腐吐酸、舌苔厚腻或黄腻脉数者[1]。牛耳枫为虎皮楠科虎皮楠属植物牛耳枫DaphniphyllcalycinumBenth.的干燥带叶茎枝，具有清热解毒、止痛消肿、祛风活血的功能。牛耳枫是海南省优势黎药品牌产品枫蓼肠胃康制剂的君药，主要含有芦丁、木犀草素、槲皮苷、Yuzurimine、DaPhnane、Secodaphnane等黄酮类及生物碱类成分[2-5]。辣蓼为蓼科植物伏毛蓼PolygonumpubescensBlume的干燥全草，具有祛风利湿、消肿解毒、散淤止痛、止痒杀虫等功能，主要含金丝桃苷、山奈酚、槲皮素、山奈酚-3-O-芸香苷等黄酮类成分[6-8]。枫蓼肠胃康胶囊制剂工艺中，牛耳枫和辣蓼一起加水煎煮，牛耳枫和辣蓼中的黄酮类特别是黄酮苷类成分容易被煎提出来[9-10]。研究发现，枫蓼肠胃康胶囊中芦丁、金丝桃苷、槲皮苷、山奈酚-3-O-芸香糖苷等4种黄酮苷类成分含量较高，因此，本研究选择上述4种黄酮苷类成分作为指标成分，建立枫蓼肠胃康胶囊的质量控制方法。枫蓼肠胃康制剂现有质量标准中以芦丁为指标成分进行含量测定，查阅文献资料，发现有测定枫蓼肠胃康片中山奈酚-3-O-芸香苷、没食子酸的含量的报道[11]，而采用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)同时测定枫蓼肠胃康制剂中4种黄酮苷类成分的含量未见报道。本研究采用RP-HPLC同时测定枫蓼肠胃康胶囊中芦丁、金丝桃苷、槲皮苷、山奈酚-3-O-芸香糖苷4种黄酮苷类成分的含量，并兼顾牛耳枫和辣蓼2味药的成分，为制定枫蓼肠胃康胶囊的质量标准提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1260 Series高效液相仪(包括在线脱气机、四元泵、自动进样器、柱温箱和二极管阵列检测器)；SB3200-T型数控超声仪(功率：500 W，频率：40 KHz，上海必能信超声有限公司)；AE240型十万分之一电子天平(瑞士梅牡勒公司)。

1.2 试药

对照品芦丁、金丝桃苷、槲皮苷(中国食品药品检定研究院，批号分别为100080-200707、111521-201406、111538-200905，纯度>98.0%)；山奈酚-3-O-芸香糖苷(批号：W0040010，纯度>98.0%，天津一方科技有限公司)。

枫蓼肠胃康胶囊购自于药店(批号分别为Z10980060、Z10980061、Z10980062、Z10980063、Z10980064，规格：0.37 g×12粒，海口奇力制药股份有限公司)；牛耳枫(批号：20150804)及辣蓼(批号 20151026)药材购于广东大翔药业有限公司，经湖北中医药大学陈科力教授鉴定，分别为虎皮楠科虎皮楠属植物牛耳枫DaphniphyllcalycinumBenth.的干燥带叶茎枝和蓼科植物伏毛蓼PolygonumpubescensBlume的干燥全草。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 混合对照品溶液 精密称取上述各对照品适量，加入50%乙醇制成含芦丁、金丝桃苷、槲皮苷、山奈酚-3-O-芸香糖苷分别为2.484、2.380、2.740、1.576 mg·mL-1的单一对照品储备液，分别取单一对照品储备液适量置于10 mL容量瓶中，配制成含芦丁、金丝桃苷、槲皮苷、山奈酚-3-O-芸香糖苷分别为1.242、0.595、0.685、0.788 mg·mL-1的混合对照品储备液。分别取混合对照品储备液0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL置于10 mL容量瓶中，加50%乙醇定容，配制成系列浓度的混合对照品溶液，即得。

2.1.2 供试品溶液 取枫蓼肠胃康胶囊10粒，除去胶囊壳，研细，取0.5 g，精密称定，置于50 mL具塞锥形瓶中，加50%乙醇20 mL，超声(500 W，40 KHz)提取30 min，提取2次，滤过，合并滤液定容到50 mL，过0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.1.3 阴性对照品溶液 按枫蓼肠胃康胶囊的处方工艺分别制备缺牛耳枫和辣蓼的阴性样品，再制备阴性供试品溶液，即得。

2.2 色谱条件

用Waters X bridge C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)柱；流动相：乙腈(A)-0.2%甲酸水溶液(B)，梯度洗脱(0～10 min，5%→15%A；10～25 min，15%→20%A；25～40 min，20%→35%A)；体积流量：1.0 mL·min-1；控制柱温为25 ℃；检测波长为350 nm；进样量为10 μL，色谱图见图1。

2.3 含量测定方法学考察

2.3.1 线性关系考察 分别精密吸取2.1.1项下系列浓度的混合对照品溶液10 μL，进样分析，记录各色谱峰面积。以进样浓度(X，μg·mL)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，绘制标准曲线，芦丁、金丝桃苷、槲皮苷、山奈酚-3-O-芸香糖苷等4种黄酮苷成分的线性范围、回归方程见表1；以信噪比(S/N)为3∶1和10∶1为基准测得各化合物的检测限和定量限，结果见表1。

2.3.2 精密度试验 精密吸取上述4种黄酮苷成分的混合对照品溶液10 μL，连续进样6次，结果芦丁、金丝桃苷、槲皮苷、山奈酚-3-O-芸香糖苷峰面积的RSD分别为1.1%、1.2%、0.79%、0.93%(n=6)。

2.3.3 重复性试验 精密称取同一批枫蓼肠胃康胶囊(批号：Z10980060)6份，按2.1.2方法制备供试品溶液，进样分析，记录峰面积值并计算各成分含量，结果芦丁、金丝桃苷、槲皮苷、山奈酚-3-O-芸香糖苷的平均含量分别为0.51、0.33、0.26、0.80 mg/粒，RSD分别为1.6%、1.3%、0.97%、1.9%，表明本方法重复性良好。

注：A.混合对照品；B.枫蓼肠胃康胶囊样品；C.缺辣蓼阴性样品；D.缺牛耳枫阴性样品；1.芦丁；2.金丝桃苷；3.槲皮苷；4.山奈酚-3-O-芸香糖苷。图1 对照品与样品HPLC色谱图

成分线性方程r线性范围/μg·mL检测限/ng定量限/ng芦丁Y=21×103X-3296099991242～31050102093金丝桃苷Y=20×103X+1153709999595～14875130054槲皮苷Y=27×103X+897309999685～17125204107山奈酚⁃3⁃O⁃芸香糖Y=21×103X+901109999788～19700113082

2.3.4 稳定性试验 精密吸取同一份供试品(批号：Z10980060)溶液，分别在样品制备后0～24 h，每间隔4 h进样分析，进样量为10 μL，结果芦丁、金丝桃苷、槲皮苷、山奈酚-3-O-芸香糖苷峰面积的RSD分别为0.87%、1.6%、1.9%、1.2%，表明样品中上述4种黄酮苷成分在24 h内稳定。

2.3.5 加样回收率试验 取枫蓼肠胃康胶囊(批号：Z10980060)粉未6份，每份约0.25 g，精密称定，分别置具塞三角锥瓶中，精密加入2.1.1项的芦丁、金丝桃苷、槲皮苷、山奈酚-3-O-芸香糖苷的单一对照品储备液适量，按2.1.2项的方法制备供试品溶液，按2.2项的色谱条件进样，进样量为10 μL，计算各成分的回收率，结果详见表2。

表2 加样回收率试验结果(n=6)

表2(续)

2.4 样品测定

取5批枫蓼肠胃康胶囊样品，按2.1.2项的方法制备供试品溶液，进样分析，进样量为10 μL，计算含量，结果详见表3。

表3 枫蓼肠胃康胶囊中4种黄酮苷成分的含量(n=3) mg/粒

3 讨论

3.1 提取方法的选择

实验比较了不同浓度的乙醇(30%、50%、70%、80%、100%)对4种黄酮苷成分提取率的影响。结果显示，采用50%乙醇为提取溶剂，4种黄酮苷成分提取率高且杂质干扰小。对超声处理时间、溶媒用量和提取次数进行考察，发现用40倍量的50%乙醇超声处理30 min，提取2次即可保证4种活性成分被提取完全。因此，选择50%乙醇为提取溶剂，超声提取2次，每次30 min。

3.2 检测波长的选择

采用二级管阵列检测器对4种黄酮苷成分进行紫外全波长扫描，结果芦丁的最大吸收波长为255、359 nm，金丝桃苷的最大吸收波长为256、354 nm，槲皮苷的最大吸收波长为256、350 nm，山奈酚-3-O-芸香糖苷的最大吸收峰为265、346 nm，综合考滤，分别考察了255、350 nm波长，发现350 nm波长处4种黄酮苷成分的响应相对较高且杂质峰干扰较少，各组分分离度较好，故选择350 nm为本实验的检测波长。

3.3 结果分析

实验测定了海口奇力制药股份有限公司5批枫蓼肠胃康胶囊中芦丁、金丝桃苷、槲皮苷、山奈酚-3-O-芸香糖苷4种黄酮苷成分的含量，各批次样品均能检测出上述4种黄酮苷类成分。但不同批次间芦丁、金丝桃苷、槲皮苷、山奈酚-3-O-芸香糖苷的含量有一定差异，可能与牛耳枫、辣蓼原料药材的产地及采收加工有关，因此有必要对枫蓼肠胃康胶囊各有效成分进行质量控制，使制剂均一稳定，从而保证其安全有效性，该方法的建立为枫蓼肠胃康胶囊的质量评价提供依据。

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SimultaneousDeterminationofFourFlavonoidGlycosidesinFengliaoChangweikangJiaonangbyRP-HPLC

LU Qing1*，LI Jie2

(1.HubeiprovincialHospitalofIntegratedChinese&WesternMedicine,Hubei430015,China; 2.HubeiUniversityofChineseMedicine,HubeiWuhan430065,China)

Objective: To establish an RP-HPLC method for simultaneous determination of rutin, hyperoside, quercetin-3-rhamnoside and kaempferol-3-O-rutinoside in Fengliao Changweikang Jiaonang.MethodsThe Waters X bridge C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm)column was adopted; the mobile phase was methanol (A)-0.2% formic acid (B) with gradient elution, flow rate was 1.0 mL·min-1, column temperature was 25 ℃, and detection wavelength was 270 nm.ResultsThe concentration range of the four kinds of glycosides were in 12.42-310.50、5.95-148.75、6.85-171.25 and 7.88-197.00 μg·mL, respectively, and recoveries (n=6) were 98.6%、104.2%、104.5%、101.0%, respectively, RSD were 1.3%、1.1%、1.3% and 1.6%, respectively.ConclusionThe established RP-HPLC method was simple and fast, which can be used for four flavonoid glycosides of Fengliao Changweikang Jiaonang.

Fengliao Changweikang Jiaonang; rutin; hyperoside; quercetin-3-rhamnoside; kaempferol-3-O-rutinoside

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.9.020

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卢琴，副主任药师，研究方向：中药质量研究；E-mail：luqing20150601@163.com

2016-11-28)