响应面法优化何首乌二苯乙烯苷类化合物提取工艺△

唐静，黄磊

(1.华中科技大学同济医学院附属梨园医院 药剂科，湖北 武汉 430077；2.武汉市武昌医院，湖北 武汉 430063)

·中药工业·

响应面法优化何首乌二苯乙烯苷类化合物提取工艺△

唐静1，黄磊2*

(1.华中科技大学同济医学院附属梨园医院 药剂科，湖北 武汉 430077；2.武汉市武昌医院，湖北 武汉 430063)

目的通过响应面法优化何首乌二苯乙烯苷类化合物提取工艺。方法根据中心组合设计的方法，选取温度、液料比、乙醇体积分数为自变量，二苯乙烯苷提取率为响应值，利用响应面分析方法，得到回归方程的预测模型，并确定二苯乙烯苷提取工艺的最佳条件。结果何首乌二苯乙烯苷提取工艺的最佳条件为温度54 ℃、液料比18∶1(mL·g-1)、乙醇体积分数72%。在此条件下，提取率达到2.75%。结论该工艺条件可为何首乌二苯乙烯苷的提取提供参考。

响应面；何首乌；二苯乙烯苷；提取

何首乌PolygonummultiflorumThumb.是蓼科蓼族何首乌属多年生缠绕藤本植物，其干燥块根入药[1]，具有解毒(截疟)、消痈、润肠通便功能[2-3]。何首乌含有二苯乙烯类、卵磷脂、蒽醌类、黄酮类、鞣质、微量元素等物质[4]。2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷(TSG)俗称二苯乙烯苷，是何首乌二苯乙烯类中含量较高的成分之一，也是何首乌主要的有效成分。本研究选取TSG为考察指标，采用BBC中心组合实验设计，通过响应面法优化何首乌TSG的提取工艺。

1 材料

1.1 试药

何首乌饮片(湖北天济中药饮片有限公司)打粉后过80目筛，收集粉末；TSG(中国食品药品检定研究院，纯度>98%)；乙腈为色谱纯；乙醇为分析纯；水为蒸馏水。

1.2 仪器

Waters高效液相色谱仪、Empower色谱工作站(美国waters公司)；JJ224BC分析天平(常熟市双杰测试仪器厂，精度：0.1 mg)。

2 方法

2.1 何首乌提取物中二苯乙烯苷含量测定方法学的建立

2.1.1 对照品溶液的制备及标准曲线 精密称取TSG，加适量乙醇制得质量浓度为0.5 mg·mL-1的对照品溶液，分别取对照品溶液1、2、4、6、8、10 μL进样，测定峰面积，得回归方程：Y=106X-67 073，r=0.999 8，线性范围0.5g～5 μg。

2.1.2 色谱条件 色谱柱Waters Symmetry C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈-水(V乙腈∶V水=23∶77)；检测波长：310 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱温：28 ℃；进样量：10 μL。

2.1.3 供试品溶液的制备 何首乌粉末0.5 g，置于50 mL锥形瓶中，按一定的液料比，加入一定量和一定浓度的乙醇，水浴回流一定时间，合并滤液，滤过，精密吸取5 mL，即得供试品溶液。

2.2 单因素试验

分别考察提取时间、乙醇体积分数、液料比、温度对二苯乙烯苷提取率的影响。在固定实验条件(液料比为20∶1，温度为60 ℃，乙醇体积分数为70%)下，考察提取时间0.5、1、1.5、2、2.5 h对TSG提取率的影响，结果见图1。在固定实验条件(液料比为20∶1，温度为60 ℃，提取时间为1.5 h)下，考察乙醇浓度50%、60%、70%、80%、90%对TSG提取率的影响，结果见图2。在固定实验条件(乙醇体积分数为70%，温度为60 ℃、提取时间为1.5 h)下，考察液料比5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1对TSG提取率的影响，结果见图3。在固定实验条件(液料比为20∶1、乙醇体积分数为70%、提取时间为1.5 h)下，考察温度40、50、60、70、80 ℃对TSG提取率的影响，结果见图4。

图1 提取时间对TSG提取率的影响

图2 乙醇体积分数对TSG提取率的影响

图3 液料比对TSG提取率的影响

图4 温度对TSG提取率的影响

2.3 何首乌提取工艺响应面法优化

根据单因素试验结果，按照Box-Behnken实验设计原理[5]，选择提取温度(A)、液料比(B)、乙醇体积浓度(C)为自变量，以TSG提取率为响应值，采用3因素3水平的响应面分析，通过Design-Expert8.0.6.1软件进行提取工艺的优化，响应面分析因素设计方案及结果见表1～2。

表1 响应面分析因素与水平

表2 响应面分析方案及试验结果

3 结果与分析

3.1 单因素试验结果与分析

由图1可知，在1.5 h左右TSG的提取率达到最高值，随着提取时间的延长，提取率略有下降，这可能由于提取时间延长，TSG化学性质不稳定[6]，使得提取率出现了下降，因此选择提取时间为1.5 h。

由图2可看出，随着乙醇浓度的增加，TSG的提取率在增加，在70%浓度时达到峰值，随后可能由于乙醇浓度增大使溶液黏度增加，影响了成分的溶出，同时也增加了醇溶性成分的溶出，使得提取率减少，从易操作性角度考虑，选择乙醇浓度为70%。

由图3可知，TSG的提取率随着液料比的增大而增大，在液料比20∶1时达到高峰，随后出现了下降，其原因可能是乙醇量继续增加，导致更多的杂质成分溶出，反而降低了TSG的提取率，因此选择液料比为20∶1。

由图4可知，在温度达到60 ℃后，TSG的提取率一度出现了最大值，在80 ℃以后，提取率出现了明显的下降。这可能是随着温度升高，TSG的含量降低，这与文献报道一致[7-8]，说明温度影响TSG稳定性，因此选择提取温度为60 ℃。

3.2 响应面法优选提取工艺

表1中“0”代表单因素试验中的最优条件值，“-1”、“1”分别代表以最优条件为基准，在上下区域各取1个水平作为响应面法设计水平。表2为三因素三水平17个点的响应面试验水平，其中1～12是析因试验，13～17是以零点最优条件为中心的5次重复试验。通过对数据的分析，得到了提取率(Y)与各影响因素的回归方程：Y=2.73-0.12A-0.044B+0.036C+0.017AB-0.017AC-0.095BC-0.20A2-0.14B2-0.17C2。

表3 方差分析表

注：***P< 0.001为极显著；**P< 0.01为非常显著；*P< 0.05为显著。

3.3 响应面法分析各因素影响

比较表3中F值可知，对TSG提取率影响由大到小依次为提取温度(A)、液料比(B)、乙醇体积浓度(C)。等高线的形状可以反映两因素间交互作用的强弱，椭圆形表示两因素间交互作用较强，圆形则相反[9]。图5、6与图7相比更圆，故BC两因素之间的交互作用最强，且BC两因素之间的交互图曲面较陡，也支持这一点[10-11]。

图5 液料比与温度对二苯乙烯苷提取率影响的等高线图和响应面图

图6 乙醇体积分数比与温度对二苯乙烯苷提取率影响的等高线图和响应面图

图7 乙醇体积分数与液料比对二苯乙烯苷提取率影响的等高线图和响应面图

3.4 试验验证

根据模型，得到优化工艺：在53.97 ℃、液料比为17.62∶1，乙醇体积分数为71.88%，在此条件下理论提取率为2.75%。考虑到可操作性，将提取工艺改为：提取温度54 ℃，液料比18∶1，乙醇体积分数为72%。在此条件下，进行3次平行验证试验。结果显示，二苯乙烯苷的平均提取率为2.63%，与模型的误差为5.1%，说明该方程与实验情况拟合较好。

4 讨论

响应面法是采用多元二次回归方程拟合因素与响应值之间的函数关系，通过对回归方程的分析，寻找到最佳工艺的一种统计学方法，具有使用简便、精确度高、预测性好等特点[12]。本研究通过对单因素试验中确定的3个影响提取工艺的因素采用BBC法设计后，进行响应面法分析，使得TSG的实测值与预测值较为接近，说明响应面法可用于优化TSG提取工艺。

通过本实验得到了何首乌二苯乙烯苷优化后的提取工艺：提取温度54 ℃，液料比18∶1，乙醇体积分数为72%，本研究方法对TSG的提取有一定的理论指导意义。

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[3] 唐静，曾雅莉，何婷.何首乌提取物对Ⅱ型糖尿病胰岛素抵抗大鼠的影响[J].实用药物与临床，2016，19(11)：1336-1340.

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ResponseSurfaceAnalysisofExtractionforTSGfromPolygonummultiflorum

TANG Jing1，HUANG Lei2*

(1.LiyuanHospitalAffiliatedtoTongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan43007，China；2.WuchangHospitalofWuhan，Wuhan430063，China)

Objective:To optimize the extraction for 2,3,5,4-tetrahydroxyl diphenylethylene-2-O -glucoside(TSG)fromPolygonummultiflorumwith response surface methodology.Methods: Extraction temperature，liquid-solid ratio，ethanol volume，which designed by central composite were evaluated by TSG extraction yield.The response surface methodology was used to establish the prediction model of regression equation，and confirm the optimal extraction in TSG.ResultsThe optimal protocol for TSG extraction was at 54 ℃ in 72% ethanol with a liquid-solid ratio of 18∶1，the extraction yield reached 2.75%.ConclusionThe selected parameters provide a theoretical basis for TSG extraction。

Response surface analysis；Polygonummultiflorum；TSG；extraction

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.9.016

华中科技大学自主创新基金(2014QN072)

*

黄磊，主治医师，研究方向：老年医学；Tel:(027)51173147;E-mail:394579393@qq.com

2016-12-19)