PHB对高糖环境下的心肌细胞中活性氧及细胞凋亡的影响及机制研究①

李 蕊

(西安外事学院医学院，西安 710077)

PHB对高糖环境下的心肌细胞中活性氧及细胞凋亡的影响及机制研究①

李 蕊

(西安外事学院医学院，西安 710077)

目的探讨抗增殖蛋白(PHB)对高糖诱导的H9C2心肌细胞凋亡的影响以及机制研究。方法选取pCDNA3-PHB、pCDNA3-NC重组质粒转染和高糖干预心肌细胞，实验分为4组：正常对照组(Control组)、高糖刺激组(HG组)、高糖+空载体组(HG+pCDNA3-NC组)、高糖加pCDNA3-PHB重组质粒组(HG+pCDNA3-PHB)；Western blot检测细胞转染后各组细胞中PHB蛋白、B细胞淋巴瘤/白血病-2 相关X 蛋白(Bax)/B 细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、剪切的半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(c-caspase3)、蛋白激酶B(AKt)、磷酸化蛋白激酶B(p-AKt)蛋白的表达量，二氢乙啶(DHE)染色法检测高糖环境下心肌细胞内的活性氧(ROS)水平，实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测细胞中TNF-α mRNA和IL-6 mRNA含量的测定 ，流式细胞仪检测细胞的凋亡率。结果pCDNA3-PHB重组质粒可使PHB表达量增加；与Control组相比，HG组、HG+pCDNA3-NC组、HG+pCDNA3-PHB组细胞凋亡率显著增高(P<0.05)；与HG组相比，HG+pCDNA3-NC组细胞凋亡率变化不显著(P>0.05)；HG+pCDNA3-PHB组细胞凋亡率明显降低(P<0.05)。与Control组相比，HG组、HG+pCDNA3-NC组、HG+pCDNA3-PHB组细胞内ROS的水平、TNF-α mRNA、IL-6 mRNA、Bax/Bcl-2的相对表达量、c-caspase3(P<0.05)蛋白相对表达量显著增高；与HG组相比，HG+pCDNA3-NC组细胞内ROS的水平(P>0.05)、TNF-α mRNA(P<0.05)、IL-6 mRNA(P<0.05)、Bax/Bcl-2的相对表达量(P>0.05)、c-caspase3蛋白相对表达量(P>0.05)无明显差异；但pCDNA3-PHB组细胞中ROS的水平(P<0.05)、TNF-α mRNA(P<0.05)、IL-6 mRNA(P<0.05)、Bax/Bcl-2的相对表达量(P<0.05)、c-caspase3(P<0.05)蛋白相对表达量明显降低。经统计分析显示，各组细胞中AKt蛋白的相对表达量无显著差异(P>0.05)。经比较后，HG组、HG+pCDNA3-NC组、HG+pCDNA3-PHB组心肌细胞中p-AKt蛋白的相对表达量显著低于Control组(P<0.05)；HG+pCDNA3-NC组心肌细胞中p-AKt蛋白的相对表达量与HG组间无显著差异(P>0.05)；但HG+pCDNA3-PHB组心肌细胞中p-AKt蛋白的相对表达量明显高于HG组(P<0.05)。结论PHB过表达可抑制高糖环境下H9C2心肌细胞的凋亡和炎症反应，主要是通过调控PI3K/Akt信号通路、ROS、Bax/Bcl-2、c-caspase3蛋白的水平，为糖尿病心肌病的治疗提供新的思路与方法。

PHB；心肌细胞；ROS；Bax/Bcl-2；c-caspase3；Akt

近年来，机体自身代谢紊乱逐渐成为影响人类健康的慢性疾病之一，其中以糖尿病最为严重[1,2]。若机体长期发生糖代谢异常会引起各种并发症，且死亡率极高[3]。糖尿病心肌病(Diabetic cardiomyopathy，DCM)是糖尿病患者常见的并发症，主要是由于高糖环境下导致心肌细胞受到损伤而导致的增殖、凋亡机制异常，最终引起心脏功能障碍的一种疾病。糖脂代谢紊乱和氧化应激可能是引起糖尿病心肌病的重要原因[4]。抗增殖蛋白(Prohibitin，PHB)普遍存在于线粒体内膜上，是进化中具有高度保守性的蛋白[5]。据研究PHB在细胞代谢、生长、凋亡以及糖尿病等多方面发挥重要作用[6，7]。PHB发挥作用主要通过与转录抑制复合物和线粒体抗凋亡蛋白相互作用从而调控细胞的凋亡[8]。但PHB对糖尿病心肌细胞功能的影响以及作用机制尚不完全清楚。因此本实验通过体外模拟糖尿病心肌细胞的高糖状态研究PHB对H9C2心肌细胞凋亡的影响以及作用机制，以期为糖尿病心肌病治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1材料 H9C2心肌细胞购自北京北纳生物技术有限公司，胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶购自美国Gibco公司；CCK-8检测试剂盒购自江苏凯基生物技术股份有限公司；抗体均购自英国Abcam公司；pCDNA3-PHB过表达载体购自吉满生物科技(上海)有限公司；Lipofectamine 2000转染试剂盒购自美国Invitrogen 公司；DHE检测试剂盒购自上海碧云天生物技术研究所；细胞培养：H9C2心肌细胞在5%CO2、37℃的恒温培养箱中培养，待细胞贴壁后，0.25%胰酶消化，更换新的培养基继续培养，每2～3 d更换新的培养基。

1.2方法

1.2.1细胞转染及干预 细胞转染：取对数生长的H9C2心肌细胞胰酶消化后以5×104个/孔细胞接种于六孔板中培养，待细胞融合度达到80%左右时，弃去培养基，PBS清洗，每孔加入10 μl脂质体Lipofectamine 2000，室温静置5 min，pCDNA3-PHB组加入pCDNA3-PHB重组质粒，pCDNA3-NC组加入空载体，Normal组为未作处理的细胞，以β-actin为内参，Western blot 检测PHB蛋白的相对表达量。

以高糖对细胞进行干预：实验分为4组：正常对照组(Control组)、高糖刺激组(HG组)、高糖+空载体组(HG+pCDNA3-NC组)、高糖加pCDNA3-PHB重组质粒组(HG+pCDNA3-PHB)。

1.2.2高糖环境下心肌细胞中活性氧的测定 使用二氢乙啶(Dihydroethidium，DHE)染色法检测H9C2心肌细胞活性氧的表达情况。取高糖刺激48 h的心肌细胞置于六孔板中，加入DHE、DMEM细胞培养基，放入37℃恒温箱中避光培养30 min，然后缓冲液冲洗3次，荧光显微镜下检测活性氧的水平。

1.2.3流式细胞仪检测心肌细胞的凋亡率 取各组H9C2心肌细胞，胰酶消化，使细胞的浓度为1×106个/ml，1 000 r/min离心5 min后弃去上清，缓冲液清洗3次，加入5 μl Annexin V-FITC/PI，流式细胞仪检测细胞的凋亡情况。

1.2.4Western blot检测Bax/Bcl-2、c-caspase3、AKt、p-AKt蛋白表达量 取各组细胞置于EP管中，每管加入300 μl蛋白裂解液，12 000 r/min离心10 min，加入5×SDS上样缓冲液，沸水煮10 min左右，BCA法测定提取的蛋白质浓度。10% SDS-PAGE电泳后转移至PVDF上，5%的脱脂牛奶封闭30 min，加入一抗孵育过夜后TBST清洗3遍，加入二抗孵育 2 h，滴加电化学发光显色液测定灰度值，与内参β-actin的灰度值的比值表示目的蛋白的相对表达量。

1.2.5实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测细胞中TNF-α mRNA和IL-6 mRNA含量的测定 按照细胞提取RNA试剂盒说明书进行操作，提取细胞中的总RNA，琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测细胞完整性和纯度，调整RNA浓度，-80℃保存。采用反转录试剂盒将所提取的RNA进行反转录。根据Gene bank上IL-1β和IL-6的序列设计PCR引物，TNF-α的引物上游序列为5-CATTCCTGCTCGTGGCGGGG-3，下游序列为5-CGACGTGGGCTACG-GGCTTG-3，IL-6的引物上游序列为5-GTCTCGAGC-CCACCAGGAACG-3，下游序列为5-AGGGAAGGCAGTGGCTGTCAAC-3。定量PCR的反应程序为预变性94℃ 3 min；变性94℃ 30 s，退火50℃ 30 s，延伸72℃ 30 s，40 cycle，终延伸72℃ 5 min ，以cDNA为模板，GAPDH为内参，实验重复3次，取其平均数，用2-ΔΔCt法计算各组mRNA的表达量。

2 结果

2.1Western blot检测PHB蛋白的表达量 Western blot检测细胞转染pCDNA3-PHB和空载质粒后PHB蛋白的表达水平。如图1、表1所示，pCDNA3-PHB组、pCDNA3-NC组、Normal组蛋白的相对表达量分别为(1.625±0.249)、(0.762±0.094)、(0.813±0.096)；与Normal组相比，pCDNA3-PHB组心肌细胞中PHB蛋白的相对表达量明显增高，具有统计学意义(P<0.05)，pCDNA3-NC组和Normal组间差异不明显(P>0.05)。

图1 转染后H9C2心肌细胞中PHB蛋白的相对表达量Fig.1 Relative expression of PHB protein in transfected H9C2 cellsNote: 1.Normal group;2.pCDNA3-NC group;3.pCDNA3-PHB group.

GroupsPHBrelativeexpressionNormal0.813±0.096pCDNA3-NC0.762±0.094pCDNA3-PHB1.625±0.2491)

Note：Compared with normal group,1)P<0.05.

2.2PHB对高糖环境下心肌细胞中活性氧的影响 二氢乙啶(Dihydroethidium，DHE)染色高糖环境下心肌细胞内的ROS水平，可通过流式细胞术检测反映，见图2。如表2所示，Control组中ROS的值为(0.998±0.036)，HG组、HG+pCDNA3-NC组、HG+pCDNA3-PHB组的相对值分别为(4.013±0.365)、(4.168±0.401)、(1.963±0.124)；经统计分析，HG组、HG+pCDNA3-NC组、HG+pCDNA3-PHB组细胞内ROS的水平明显高于Control对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)；HG+pCDNA3-PHB组细胞内ROS的水平显著低于HG组、HG+pCDNA3-NC组(P<0.05)。

2.3PHB对高糖环境下的心肌细胞的凋亡率的影响 流式细胞术检测PHB过表达对高糖环境下的H9C2心肌细胞凋亡率的影响。结果如图3、表3所示，Control组、HG组、HG+pCDNA3-NC组、HG+pCDNA3-PHB组细胞的凋亡率分别为(8.132±0.561)%、(25.385±2.487)%、(26.159±2.169)%、(16.487±1.952)%；与Control组相比，HG组、HG+pCDNA3-NC组、HG+pCDNA3-PHB组心肌细胞的凋亡指数显著增高(P<0.05)；与HG+pCDNA3-NC组相比，HG+pCDNA3-PHB组心肌细胞的凋亡率明显降低(P<0.05)；与HG组相比，HG+pCDNA3-NC组心肌细胞凋亡率没有显著差异(P>0.05)，HG+pCDNA3- PHB组可显著降低心肌细胞的凋亡率(P<0.05)。

图2 PHB对高糖环境下心肌细胞活性氧(ROS)的影响Fig.2 Effect of PHB to cardiomyocytes reactive oxygen species(ROS) under high glucoseNote: A.Control group;B.HG group;C.HG+pCDNA3-NC group;D.HG+pCDNA3-PHB group.

2.4PHB对高糖环境下的心肌细胞中Bax/Bcl-2、c-caspase3、AKt、p-AKt蛋白表达量的影响 结果如图4、表4所示，Control组、HG组、HG+pCDNA3-NC组、HG+pCDNA3-PHB组细胞中Bax/Bcl-2的相对表达量分别为(0.462±0.048)、(1.698±0.459)、(1.586±0.874)、(0.823±0.091)；剪切的c-caspase3蛋白的相对表达量分别为(0.985±0.084)、(2.456±0.358)、(2.511±0.478)、(1.652±0.625)；蛋白激酶B(AKt)蛋白的相对表达量分别为(0.991±0.074)、(0.982±0.083)、(0.987±0.086)、(0.979±0.085)；磷酸化AKt(p-AKt)蛋白的相对表达量分别为(2.783±0.464)、(0.974±0.079)、(0.989±0.084)、(1.578±0.365)；与Control组相比，HG组、

GroupsROSrelativevalueControl0.998±0.036HG4.013±0.3651)HG+pCDNA3-NC4.168±0.4011)HG+pCDNA3-PHB1.963±0.124

Note：Compared with control group,1)P<0.05.

GroupsApoptoticrateofcardiomyocytes(%)Control8.132±0.561HG25.385±2.4871)HG+pCDNA3-NC26.159±2.1691)HG+pCDNA3-PHB16.487±1.952

Note：Compared with control group,1)P<0.05.

HG+pCDNA3-NC组、HG+pCDNA3-PHB组细胞中Bax/Bcl-2(P<0.05)、c-caspase3(P<0.05)的相对表达量显著增加，p-AKt蛋白的相对表达量显著降低(P<0.05)；与HG组相比，HG+pCDNA3-NC组心肌细胞中Bax/Bcl-2、c-caspase3、p-AKt蛋白的相对表达量差异没有显著统计学意义(P>0.05)，但HG+pCDNA3-PHB组细胞中Bax/Bcl-2和c-caspase3蛋白的相对表达量显著降低(P<0.05)，p-AKt表达明显升高。

2.5qRT-PCR检测细胞中TNF-α mRNA和IL-6 mRNA含量的测定 结果如表5所示，Control组、HG组、HG+pCDNA3-NC组、HG+pCDNA3-PHB组细胞的TNF-α mRNA为(2.623±0.286)、(5.592±0.550)、(5.650±0.591)、(3.672±0.344)；IL-6mRNA为(1.877±0.262)、(4.156±0.480)、(4.298±0.552)、(3.112±0.421)。与Control组相比，HG组、HG+pCDNA3-NC组、HG+pCDNA3-PHB组心肌细胞的TNF-α mRNA、IL-6 mRNA显著增高(P<0.05)；与HG组相比，HG+pCDNA3-NC组心肌细胞中TNF-α mRNA、IL-6 mRNA没有显著差异(P>0.05)，HG+pCDNA3-PHB组可显著降低心肌细胞中TNF-α mRNA、IL-6 mRNA的表达量(P<0.05)。

图3 PHB对高糖环境下心肌细胞凋亡率的影响Fig.3 Effect of PHB to cardiomyocytes apoptosis rate under high glucoseNote: A.Control group;B.HG group;C.HG+pCDNA3-NC group;D.HG+pCDNA3-PHB group.

GroupsProteinrelativeexpressionBax/Bcl-2c-caspase3AKtp-AKtControl0.462±0.0480.985±0.0840.991±0.0742.783±0.464HG1.698±0.4591)2.456±0.3581)0.982±0.0830.974±0.0791)HG+pCDNA3-NC1.586±0.8741)2.511±0.4781)0.987±0.0860.989±0.0841)HG+pCDNA3-PHB0.823±0.0911.652±0.6250.979±0.0851.578±0.365

Note：Compared with control group,1)P<0.05.

图4 Western blot检测心肌细胞Bax/Bcl-2、c-caspase3、AKt、p-AKt蛋白表达量Fig.4 Expression of Bax/Bcl-2，c-caspase3，AKt and p-AKt protein in cardiomyocytes by Western blotNote: 1.Control group;2.HG group;3.HG+pCDNA3-NC group;4.HG+pCDNA3-PHB group.

GroupsTNF-αIL-6Control2.623±0.2861.877±0.262HG5.592±0.5501)4.156±0.4801)HG+pCDNA3-NC5.650±0.5911)4.298±0.5521)HG+pCDNA3-PHB3.672±0.3443.112±0.421

Note：Compared with Control group,1)P<0.05.

3 讨论

PHB属于细胞膜蛋白超家族蛋白之一，在正常人体细胞中广泛存在，发挥多种作用，是一种进化保守、表达广泛的基因。研究显示，PHB在细胞的能量代谢、增殖、凋亡等过程中发挥重要作用[9,10]。PHB是常见的分子伴侣，可以通过抑制丙酮酸羧化酶的作用，调控细胞新陈代谢[11]。研究发现，PHB过表达可调节新陈代谢的氧化磷酸化转化为无氧酵解，降低糖分解，从而改善体内糖代谢[12]。PHB可作用于细胞周期中重要的转录因子E2F从而抑制细胞的增殖[13]。同时PHB还可与多种抗凋亡因子结合从而调控细胞的凋亡[11]。成年心肌细胞属于非再生型细胞，无增殖能力，细胞若长期受损或者凋亡将会导致心肌细胞丢失，严重影响心室的收缩与舒张功能，是心脏功能障碍的重要原因之一。本实验发现高糖环境可诱导心肌细胞的凋亡，但PHB过表达后拮抗高糖促进凋亡细胞的作用，说明PHB的表达量在一定程度上抑制糖尿病心肌细胞的凋亡，有助于缓解糖尿病心肌病的恶化。

活性氧(ROS)是机体受到刺激时产生的一组不稳定、含氧的活性分子化合物的统称，具有较高的化学活性，对生物体以及细胞的生理活动起重要的调节作用。当机体处于生理状态下且无外界刺激时，ROS的分泌量较少，对调节细胞稳态、免疫、信号转导等生理过程有重要作用。有研究证明当机体处于病理状态下或者受到某些因素的刺激下，ROS的分泌量增多，可与细胞内蛋白质、细胞器、DNA等分子相互作用，引起细胞结构和功能障碍，最终导致心肌细胞受到损伤或者促进其凋亡，从而诱导疾病的产生[14]。Fiorini等[15]的研究报道指出高浓度的ROS和抗氧化损伤防御系统的缺陷可促进细胞凋亡，这为药物诱导ROS的生成治疗疾病提供了理论依据。据报道ROS可通过介导氧化应激反应调节心肌细胞的凋亡过程[16]。TNF-α 和IL-6是重要的炎症介质，促进细胞增殖和分化，并参与某些自身免疫病的病理损伤。本实验结果显示，高糖环境可诱导H9C2心肌细胞中的ROS、TNF-α 、IL-6的生成增多，但PHB过表达可以改善高糖环境下ROS、TNF-α 、IL-6的生成，说明PHB可通过调节细胞体内的ROS、TNF-α 、IL-6的生成从而影响心肌细胞的凋亡率，但具体的作用机制还不完全清楚。

Bax和 Bcl-2是调控细胞凋亡过程的重要因子，位于细胞质中，其中Bax促进细胞的凋亡，Bcl-2抑制细胞的凋亡。当细胞受到损伤时，细胞内信号转导途径被激活引起促凋亡蛋白Bax的活性，使线粒体膜的通透性增加，大量细胞色素C穿过膜组织进入细胞质，激活细胞凋亡途径，促进细胞凋亡[17]。但当Bax活性增强时，Bcl-2可与其形成异源二聚体减少线粒体膜的通透性，抑制Bax的促凋亡作用[18]。因此二者的比例对细胞凋亡途径起到重要作用。c-caspase3是细胞凋亡途径的核心蛋白酶，在各种凋亡程序中发挥关键性作用[19]。根据多方研究表明机体异常状态下激活磷脂酰肌醇-3-激酶-蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号通路[20，21]，调节其下游的多种效应分子从而促进细胞的凋亡。本实验结果显示高糖环境下心肌细胞中Bax蛋白、c-caspase3蛋白的表达量增加，Bcl-2蛋白、p-AKt蛋白的表达量降低；PHB可通过调节高糖环境下心肌细胞中Bax/Bcl-2的比值和PI3K/Akt信号通路，降低c-caspase3蛋白的相对表达量，降低细胞的凋亡率。

综上所述，PHB过表达通过调控PI3K/Akt信号通路、ROS、Bax/Bcl-2、c-caspase3的表达量，抑制炎症反应，降低心肌细胞凋亡率，防止DCM进一步恶化，为DCM治疗新方法的创建提供理论依据。

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StudyeffectsandmechanismofPHBonreactiveoxygenspeciesandapoptosisincardiomyocytesunderhighglucose

LIRui.

Xi′anExternalAffairsInstituteSchoolofMedicine，Xi′an710077,China

Objective:To investigate the effect and mechanism of PHB on the apoptosis of H9C2 cardiomyocytes under high glucose.MethodsSelect pCDNA3-PHB and pCDNA3-NC recombinant plasmid transfect into cardiomyocytes and effected by high glucose.The experiment were divided into four groups:control group,high glucose group(HG group),high glucose+ empty vector group(HG+ pCDNA3-NC group),high glucose+ pCDNA3-PHB plasmid group(HG+ pCDNA3-PHB group).The expression of PHB,Bax/Bcl-2,c-caspase3,AKt and p-AKt protein after transfected were detected by Western blot.ROS were detected under high glucose by DHE staining.The TNF-α mRNA and IL-6 mRNA were detected by Real-time quantitative PCR(qRT-PCR).Flow cytometry was used to detect the apoptotic rate.ResultsThe recombinant plasmid pCDNA3-PHB could increase the expression of PHB.The apoptotic rate of HG group,HG+ pCDNA3-NC group and HG+ pCDNA3-PHB group were significantly higher than control group(P<0.05).Compared with HG group,the apoptotic rate of HG+ pCDNA3-NC group was not significant(P> 0.05),but that of HG+ pCDNA3-PHB group was significantly lower(P<0.05).The levels of ROS,TNF-α mRNA,IL-6 mRNA，Bax/Bcl-2 and c-caspase3(P<0.05) protein in the HG group,HG+ pCDNA3-NC group,HG+ pCDNA3-PHB group were significantly higher than the control group.Compared with HG group,the level of ROS,TNF-α mRNA,IL-6 mRNA,Bax/Bcl-2 and c-caspase3 (P>0.05)protein in the HG+ pCDNA3-NC group were no significant difference,but the ROS,TNF-α mRNA,IL-6 mRNA、Bax/Bcl-2 and c-caspase3 (P<0.05)protein in the HG+ pCDNA3-PHB group were significantly decreased.Statistical analysis showed that there was no significant difference of AKt protein in each group(P> 0.05).The relative expression of p-AKt protein in HG group,HG+ pCDNA3-NC group and HG+ pCDNA3-PHB group were significantly lower than that in control group(P<0.05),HG+ pCDNA3-NC group was no significantly different than HG group(P> 0.05),However,HG+ pCDNA3-PHB group was significantly higher than HG group(P<0.05).ConclusionPHB overexpression can inhibit the apoptosis of H9C2 cardiomyocytes in high glucose environment,andreduce the inflammatory response by effected the regulation of PI3K/Akt signaling pathway,reduced ROS,Bax/Bcl-2,c-caspase3 protein levels,that give us a new ideas and methods of DCM.

PHB；Cardiomyocytes；ROS；Bax/Bcl-2；c-caspase3；Akt

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.12.007

R329.2

A

1000-484X(2017)12-1789-06

①本文受陕西省科技厅社会发展公关项目(2016SF-220)资助。

李 蕊(1982年-)，女，硕士,副教授，主要从事慢性病防治方面的研究,E-mail:alaalachong@163.com。

[收稿2017-07-14]

(编辑 许四平 刘格格)