p21蛋白激活激酶4在乳腺癌上皮间质转化中的作用研究①

米旭光 李首庆 刘 磊 芦小单 方艳秋 谭 岩

(吉林省人民医院医学诊治实验中心,长春 130021)

p21蛋白激活激酶4在乳腺癌上皮间质转化中的作用研究①

米旭光 李首庆 刘 磊 芦小单 方艳秋 谭 岩

(吉林省人民医院医学诊治实验中心,长春 130021)

目的探讨p21蛋白激活激酶4(PAK4)在乳腺癌细胞上皮间质转化中的作用。方法在乳腺癌MCF7细胞中超表达PAK4，而在乳腺癌MDA-MB-231细胞中干扰PAK4表达，通过迁移和侵袭实验检测其对乳腺癌细胞迁移侵袭的影响，荧光定量法和免疫印迹分析检测PAK4、E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin mRNA和蛋白质表达量变化，免疫印迹法检测EMT相关转录激活因子Snail、Slug表达量变化。结果MCF7细胞超表达PAK4后，细胞的迁移侵袭能力显著增加，并且上皮标志分子E-Cadherin蛋白表达下调，而间质标志分子N-Cadherin和Vimentin蛋白则表达上调，EMT相关转录激活因子Slug表达量增加；MDA-MB-231细胞中，抑制内源PAK4表达能显著降低细胞的迁移侵袭能力，上调E-Cadherin蛋白表达，下调N-Cadherin、Vimentin和Slug蛋白的表达。结论PAK4通过上调Slug促进乳腺癌发生上皮间质转化，可作为抑制乳腺癌转移的分子靶点。

乳腺癌；p21蛋白激活激酶4；上皮间质转化

发生转移是导致乳腺癌患者死亡的主要因素，乳腺癌转移常伴随着对常规疗法的耐受，因此极难治愈，五年生存率低于25%，平均生存时间只有18～30个月[1，2]。p21激活激酶4(p21-activated kinase，PAK4)是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，进化上高度保守，在正常乳腺组织中低水平表达，在大多数乳腺癌中异常高表达，促进了乳腺肿瘤恶性进展，与肿瘤发生的多种标志现象密切相关，如非停泊性生长、促进肿瘤细胞存活、转移和侵袭等[3-5]。有研究显示PAK4蛋白在乳腺肿瘤恶性转化中发挥关键作用，另外PAK4过表达会使上皮来源的乳腺癌去上皮特征发生恶性转化[6]。因此，PAK4可能是乳腺癌中EMT发生的关键基因，故探索PAK4与乳腺癌EMT的关系机制，对于乳腺癌的治疗干预及新治疗靶点的发掘具有重要的科学意义。

1 材料与方法

1.1实验材料、试剂 Transwell小室购自Corning公司、基质胶购自Sigma公司、Lip2000购自Thermo公司、鼠抗PAK4、GAPDH、E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin和HRP标记羊抗鼠二抗购自CST公司、pRNAT-U6.1/Hygro-PAK4干扰载体为本实验室构建、荧光定量试剂购自Roche公司、其他化学试剂购自北京化工。

1.2实验方法

1.2.1细胞培养 乳腺癌MDA-MB-231细胞和乳腺癌MCF7细胞，用含10%新生牛血清(Corning公司)的DMEM培养基(Invitrogen公司)，添加含青霉素100 U/ml，链霉素100 μg/ml，37℃ 5%CO2条件下培养，细胞生长至对数期时传代。

1.2.2脂质体法转染 在6孔细胞培养板中接种1×106个细胞,24 h后将细胞培养液换成无双抗血清的不完全培养液。在250 μl无双抗血清培养液中按说明书比例混合脂质体与待转染质粒，室温孵育20 min，将混合液加入到细胞中并混匀。培养5 h后，将培养液换成完全培养液。

1.2.3免疫印迹分析 细胞总蛋白加入5×蛋白上样缓冲液后煮沸10 min,选择12%SDS-PAGE预制胶进行常规电泳，转膜2 h。转印膜封闭24 h，洗液清洗转印膜3次，标记一抗(1 000倍稀释)室温1.5 h，洗液清洗转印膜3次，标记羊抗鼠/兔二抗(1 000倍稀释)，洗液清洗转印膜3次，ECL显影。

1.2.4荧光定量分析 采用Trizol法提取细胞总RNA，逆转录成cDNA，应用SYBR Green法定量检测PAK4、E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin mRNA表达量。按试剂说明书要求制备反应管，ABI 7500中95℃预变性30 s，然后40循环的扩增反应(95℃ 5 s，60℃ 34 s)，同时熔解曲线分析，结果与内参作比表示mRNA拷贝数。定量检测引物序列PAK4、E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin和GAPDH[7,8]。

1.2.5迁移、侵袭能力的检测 换用无血清的DMEM培养基24 h后重悬细胞，在Transwell小室中接种200 μl细胞(浓度1×105ml-1)(侵袭实验则在小室内预铺Matrigel胶)，在下室中加入600 μl含有20%血清的DMEM培养基，37℃ 5%CO2培养24 h。PBS冲洗小室，95%的乙醇固定小室，擦除小室内黏附的细胞后结晶紫染色，显微镜下随机选择5个视野(200×)，记录穿透小室的细胞数量，取平均值，每实验组设3个重复，每组实验均重复3次。

2 结果

2.1超表达PAK4促进乳腺癌MCF7细胞发生上皮间质转化 在乳腺癌MCF7细胞中，超表达PAK4后，免疫印迹分析PAK4蛋白质表达量变化，PAK4蛋白质(图1A)表达量增加；迁移(图1B)和侵袭(图1C)能力较对照显著增强。进一步通过荧光定量及免疫印迹检测EMT相关标志分子的mRNA和蛋白质表达变化(图2)，上皮标志分子E-Cadherin表达下调，而间质标志分子N-Cadherin和Vimentin表达上调。

2.2干扰PAK4表达对乳腺癌MDA-MB-231细胞EMT的影响 在乳腺癌MDA-MB-231细胞中，抑制内源PAK4表达后，免疫印迹分析PAK4蛋白质表达(图3A)减少；迁移(图3B)和侵袭(图3C)能力较对照显著降低。进一步，通过荧光定量及免疫印迹检测EMT相关标志分子的mRNA和蛋白质表达变化(图4)，上皮标志分子E-Cadherin表达上调，而间质标志分子N-Cadherin和Vimentin表达下调。

图1 超表达PAK4对乳腺癌MCF7细胞的影响Fig.1 Effect of exogenous PAK4 expression in MCF-7 cellsNote: A.The protein expression of PAK4 in MCF7 cells transfected with Pc-PAK4;B.Number of migrated cells;C.Number of invaded cells.**.P<0.01.

图2 超表达PAK4诱导MCF-7细胞发生EMTFig.2 Effect of exogenous PAK4 expression induces mesenchymal phenotype in MCF-7 cellsNote: A.Relative mRNA change;B.Protein expression.**.P<0.01.

图3 干扰PAK4表达对乳腺癌MDA-MB-231细胞的影响Fig.3 Effect of silencing of PAK4 in MDA-MB-231 cells in breast cancerNote: A.The protein expression of PAK4 in MDA-MB-231 cells transfected with PAK4 shRNA;B.Number of migrated cells;C.Number of invaded cells.*.P<0.05；**.P<0.01.

图4 干扰PAK4表达对乳腺癌MDA-MB-231细胞EMT的影响Fig.4 Effect of silencing of PAK4 suppresses mesench-ymal phenotype in MDA-MB-231 cellsNote: A.Relative mRNA change;B.Protein expression.*.P<0.05；**.P<0.01.

2.3PAK4对乳腺癌细胞EMT相关转录因子的影响 进一步，通过免疫印迹检测PAK4对EMT相关转录因子的影响，在乳腺癌MCF7细胞超表达PAK4后(图5A)，Slug表达升高；乳腺癌MDA-MB-231细胞抑制内源PAK4表达后(图5B)，Slug表达降低。

图5 PAK4对乳腺癌细胞EMT相关转录因子表达的影响Fig.5 Effect of PAK4 on EMT of in breast cancer cellsNote: The protein expression of Snail and Slug in MCF-7 cells or MDA-MB-231 cells transfected with Pc-PAK4 or PAK4 shRNA.

3 讨论

近年我国乳腺癌发病呈现年轻化态势，且发病率的增长速度也不断增加[9]。乳腺癌患者死亡的主要原因是发生转移，而转移常伴随着对于乳腺癌治疗的耐受，极难治愈。上皮间质转化(EMT)是指上皮细胞向间质细胞转化的现象，在恶性肿瘤的发生、发展、侵袭及转移过程中发挥重要作用[10]。EMT作为乳腺癌恶变及转移的基础，找到抑制乳腺癌EMT的分子靶标对于突破乳腺癌治疗现状有至关重要的意义。EMT的发生与多个信号转导途径的激活有关，如Wnt/β-catenin、Hedgehog(Hh)、Smad和PI3K/AKT信号通路[11]。

p21激活激酶4在大多数乳腺癌中存在异常高表达，并促进了乳腺肿瘤的恶性进展，与乳腺癌的非停泊性生长、存活、转移和侵袭等方面密切相关[3-5]。乳腺癌MCF7迁移侵袭力较差[12]，在本研究中，通过外源转染表达PAK4蛋白，显著提高了MCF7细胞的迁移侵袭能力，说明PAK4是乳腺癌恶变的关键基因。另外，超表达PAK能下调MCF7细胞中上皮标志分子E-Cadherin蛋白的表达量，上调间质标志分子N-Cadherin和Vimentin蛋白的表达量，说明PAK4在乳腺癌细胞EMT过程中发挥重要作用，其促使乳腺癌细胞恶变的机制部分是通过促进EMT过程实现。而进一步对EMT相关转录因子进行检测，超表达PAK4能上调Slug表达，说明PAK4可能是通过激活Slug进而促进乳腺癌发生EMT。乳腺癌MDA-MB-231细胞恶性度高，迁移侵袭能力强[12]，通过外源转染PAK4 shRNA载体抑制内源PAK4蛋白表达后，MDA-MB-231细胞的迁移侵袭能力受到抑制，进而检测EMT相关标志分子，发现E-Cadherin蛋白表达上调，而N-Cadherin、Vimentin和Slug蛋白表达下调，说明抑制内源PAK4表达使MDA-MB-231细胞去间质化，恶性度降低。这些结果均证实PAK4是乳腺癌EMT进程的关键分子，PAK4可作为转移性乳腺癌治疗的新靶点。

[1] 黄哲宙，陈万青，吴春晓,等.中国女性乳腺癌的发病和死亡现况——全国32个肿瘤登记点2003-2007年资料分析报告[J].肿瘤,2012,32(6):435-439.

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StudyofPAK4inducesepithelial-mesenchymaltransitionofbreastcancercells

MIXu-Guang，LIShou-Qing,LIULei,LUXiao-Dan,FANGYan-Qiu,TANYan.

CenterforMedicalTreatmentandDiagnosis,JilinProvincePeople′sHospital,Changchun130021,China

Objective:To analyze the effect of p21 protein activated kinase 4 (PAK4) on epithelial-mesenchymal transition of breast cancer cells.MethodsThe mRNA and protein expression of PAK4,E-Cadherin,N-Cadherin and Vimentin were detected by qRT-PCR and Western blot in breast cancer cells transfected with pcDNA-PAK4 or siRNA PAK4;The biology behaviors of MCF-7 cells and MDA-MB-231 cells transfected with pcDNA-PAK4 or siRNA PAK4 were analysed by cell migration assay,invasion assay.ResultsOverexpressing PAK4 could significant increase in the migration and invasion compared with vector-infected cells,decrease the expression of epithelial marker E-cadherin and upregulate the expression of mesenchymal markers N-cadherin and Vimentin in detached MCF7 cells.Silenced PAK4 gene in detached MDA-MB-231 cells could suppress the migration and invasion,decrease the levels of the mesenchymal markers and increased the levels of the epithelial markers at both mRNA and protein levels.ConclusionPAK4 plays a key role in EMT of breast cancer cells,and its promoting EMT effect associated with upregulating the expression of Slug.

Breast cancer;p21 protein activated kinase 4;Epithelial-mesenchymal transition

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.12.003

R735.7

A

1000-484X(2017)12-1771-04

①本文为吉林省科技发展计划项目(20150520047JH)和吉林省科技厅重点实验室建设专项基金(20150622024JC，20160622008JC)。

米旭光(1983年-)，男，博士，助理研究员，主要从事肿瘤靶向治疗方面的研究，E-mail:mixg699@163.com。

及指导教师：方艳秋(1968年-)，女，博士，教授，主要从事肿瘤免疫治疗方面的研究，E-mail:yq.fang@163.com。

[收稿2017-09-10]

(编辑 许四平 刘格格)