miR-143调控PAN3蛋白的表达对B细胞淋巴瘤细胞侵袭和迁移的影响①

杨 满 吴 隼 张灵秀 黄 琰 字友梅 张 媛

(新乡医学院第一附属医院血液科，卫辉 453100)

miR-143调控PAN3蛋白的表达对B细胞淋巴瘤细胞侵袭和迁移的影响①

杨 满 吴 隼 张灵秀 黄 琰 字友梅 张 媛

(新乡医学院第一附属医院血液科，卫辉 453100)

目的探讨miR-143调控PAN3蛋白的表达对B细胞淋巴瘤细胞侵袭和迁移的影响。方法运用qPCR实验检测miR-143在正常骨髓组织和淋巴瘤血液组织中的表达情况；检测在不同种类的细胞株中miR-143的表达水平；qPCR检测miR-143对PAN3的表达水平的影响；双荧光素酶实验检测miR-143和PAN3之间的相互关系；划痕实验和Transwell侵袭实验检测miR-143表达对B细胞淋巴瘤E6-1细胞迁移和侵袭能力的影响。结果和正常骨髓组织相比，miR-143在B细胞淋巴瘤中表达明显下调；选取miR-143表达水平较低的E6-1细胞株；双荧光素酶实验表明miR-143可以下调PAN3的表达水平，直接影响PAN3的表达活性；过表达miR-143后，E6-1细胞的侵袭和迁移能力明显受到抑制，抑制E6-1细胞的侵袭转移能力。结论miR-143可以通过调控PAN3的表达，从而调节B细胞淋巴瘤细胞的迁移和侵袭行为。

miR-143；淋巴瘤；PAN3；Transwell

B细胞淋巴瘤是血液系统肿瘤中发病率很高的恶性肿瘤类型之一，在全球居第三位，在我国居第二位[1]。其最常见的致死原因是B细胞淋巴瘤早期诊断困难，容易转移至面部，四肢甚至全身其他器官，合并多种并发症，导致其死亡率居高不下[2]。尽管近期关于B细胞淋巴瘤的诊断治疗取得很大进展，但是其化疗、放疗的复发情况改善不佳，所以研究探讨新的分子靶向机制是B细胞淋巴瘤诊断和治疗方向上的研究热点。

miRNA 可以通过与其靶基因的 mRNA 特定结合位点的碱基互补配对，形成转录复合物，抑制相关蛋白的表达，达到调控其生物学功能的作用[3]。尤其是目前研究表明，miRNA 可以对肿瘤相关基因进行调控，达到抑癌或促癌的效果[4]。miR-143在多种肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移过程中都扮演着一定的作用。新近研究发现，miR-143对前列腺癌、胃癌细胞和肝癌细胞均有一定的抑制效果[5]。不过关于miR-143在B细胞淋巴瘤细胞中的表达情况及作用机制尚未有相关研究报道指出。

PAN3蛋白属于RAS家族成员中的一个保守蛋白，其在细胞凋亡的进程中扮演重要角色，可以抑制凋亡蛋白酶的活性，抑制细胞的过度凋亡[6]。由于PAN3蛋白的编码序列较为保守，其在多种细胞中都有表达[7]。最近研究表明其可以和上游mRNA的相关联系对肿瘤细胞进行共同调控[8]。

本研究旨在探讨miR-143在B细胞淋巴瘤细胞中的表达及对B细胞淋巴瘤细胞侵袭、迁移能力的影响，明确miR-143在B细胞淋巴瘤细胞中和PAN3蛋白的相关关系，探讨其可能的作用方式。

1 材料与方法

1.1材料 B细胞淋巴瘤细胞株BJAB、A20，E6-1和OCI-LY3均获自武汉大学典型培养物保藏中心。细胞培养条件：在RPMI1640培养基中加入1%青霉素/链霉素。用5%胎牛血清在5%CO2空气湿润培养箱中37℃恒温培养。鼠克隆单抗PAN3购于Sigam公司(Sigam，FLJ40270)。miR-143-mimic购买于上海吉玛基因有限公司。Lipofecta mine2000转染试剂购于TaKaRa公司。

1.2方法

1.2.1临床标本采集与处理 收集2016年1月～8月在医院手术切除并且经病理检查确诊为B细胞淋巴瘤的血液样本20例，同时取正常人血液样本20例。样本获取得到医院伦理委员会的批准同意，患者均签署知情同意书。

1.2.2qPCR试验 qPCR法检测miR-143表达。将E6-1细胞接种于六孔板，接种密度为1×106L-1， 培养36 h后按照Trizol说明操作提取组细胞总RNA，检测mRNA的浓度和纯度。用在SsoFast EvaGreen试剂(Bio-Rad)中以1∶10稀释的cDNA进行qPCR测量。 将表达数据标准化至相应的参照基因。根据2-ΔΔCT法计算检测基因反应条件为：37℃ 15 min，98℃ 5 min。根据PCR试剂盒说明书进行PCR反应。获得数据以RQ=2-ΔΔCT计算mRNA表达量。

1.2.3双荧光素酶试验 通过双荧光素酶确证miR-143能够靶向作用于PAN3。本实验将PAN3的3′UTR区构建入双光素酶报告基因载体。本次所用的双荧光素酶报告基因实验的载体包含两个荧光素酶报告基因：一个是海肾荧光素酶报告基因，一个是荧火虫荧光素酶报告基因，后者作为内对照。将其分为NC组和miR-143-mimic组，分别使用不同的类似物处理，将上述基因的3′UTR构建到海肾荧光素酶报告基因的直接下游区，如果3′UTR能够被miR-143识别，则该3′UTR前面基因Luciferase的表达将被抑制，对比两组之间的差异。

1.2.4划痕愈合试验 将细胞密度调整为 5×105个/ml，接种到6孔板中，放置于5%CO2温箱孵育过夜，使细胞汇合度达到 100%。细胞划痕先用 Marker 笔在每个孔的背面做好标记，以保证获取数据的位置保持一致。用灭过菌的枪头比着直尺，垂直于标记线快速进行划痕。并用 PBS 缓冲液反复冲洗细胞孔，去除悬浮细胞。向培养孔加入不含血清的1640培养基，放置于 5%CO2的 37℃孵箱孵育。按照试验设计中的时间点取样，在显微镜下拍照。测量划痕的初始距离(0 time)；在24、48、72 h后，分别测量划痕的距离，并拍照，计算细胞的迁移率。实验重复3次。

1.2.5Transwell细胞侵袭试验 所有试剂及器材均于冰上预冷，将Transwell小室置于24孔板内，将Transwell小室内膜均匀涂抹Matrigel胶50 μl(0.2 μg/μl)，37℃孵育15 min，凝固胶后；消化、离心、计数B细胞淋巴瘤细胞后，按照2.5×104ml-1用无血清培养基稀释细胞，制成细胞悬液；按照每孔200 μl，将细胞悬液加入Transwell上室，同时在Transwell下室加入10%FBS+培养基600 μl，放入37℃孵箱培养；甲醛固定，结晶紫染色10 min，然后用棉签轻轻擦拭内膜上的细胞。显微镜下技术，计数4个高倍视野(×40)下穿过滤膜的细胞数。实验重复3次。

2 结果

2.1检测不同B细胞淋巴瘤细胞株中miR-143的表达 通过qPCR实验检测正常骨髓样本和B细胞淋巴瘤样本中miR-143的表达水平，miR-143在正常骨髓细胞中的表达水平相对较高[(85.62±6.21)% vs(18.6±2.62)%,P=0.016]。在不同B细胞淋巴瘤细胞中，miR-143的表达水平不尽相同，我们选取表达水平较低的E6-1细胞株作为后续试验对象，见图1。

2.2双荧光素酶实验检测miR-143和PAN3之间的关联 为了寻找miR-143的下游靶点，我们利用生物信息学分析，发现miR-143的序列与下游PAN3基因的部分序列有相同的结合位点。我们通过双荧光素酶标记实验进行验证，首先我们构建了PAN3携带3′-UTR的荧光素酶报告因子，其中每个基因的结合位点与miR-143结合位点相对应。荧光素酶测定显示miR-143下游结合3′-UTR结合位点PAN3相符合，过表达miR-143过后可以导致荧光素酶活性的显著降低(图2C)。过表达miR-143后可明显下调B细胞淋巴瘤细胞中PAN3的表达(图2A、B)。上述结果表明miR-143可以调控下游PAN3蛋白表达情况，可能是通过调控PAN3的表达影响B细胞淋巴瘤细胞株的生物学行为。

2.3miR-143表达影响B细胞淋巴瘤细胞迁移能力 为了研究miR-143对B细胞淋巴瘤细胞增殖能力的影响，使用E6-1细胞株进行质粒转染以增加miR-143的表达。通过MTT实验检测miR-143对E6-1细胞迁移能力的影响。miR-143-mimic组的细胞生长速度比其对照组明显降低[(88.15±8.25)% vs(52.34±3.25)%,P<0.01]，培养72 h后抑制效果显示具有统计学意义(图3A、B)。综上所述，miR-143可以调控E6-1细胞的迁移能力。

图1 miR-143在B淋巴细胞瘤和细胞株中的表达情况Fig.1 Expression of miR-143 in B lymphoma and cell linesNote: A.miR-143 expression levels in normal bone marrow and B-cell lymphoma samples；B.miR-143 expression levels in different cell lines.

图2 miR-143和PAN3蛋白之间的相互关系Fig.2 Correlation between miR-143 and PAN3 proteinsNote: A,B.miR-143-mimic regulation of miR-143 and PAN3 expression levels;C.Double luciferase assay to detect the relationship between miR-143 and PAN3.

2.4miR-143表达影响B细胞淋巴瘤细胞侵袭能力 为了研究miR-143对B细胞淋巴瘤细胞侵袭能力的影响，使用HT-29细胞株进行质粒转染以增加miR-143的表达。通过Transwell侵袭实验检测miR-143对HT-29细胞侵袭能力的影响。miR-143-mimic组细胞的侵袭数目比其对照组明显降低[78.95±6.62)% vs(18.26±3.26)%,P<0.01]，差异显示具有统计学意义(图4)。结果显示，过表达miR-143后可以明显抑制E6-1细胞株的侵袭能力。

图3 划痕愈合试验检测miR-143对E6-1细胞迁移能力的影响Fig.3 Scratch healing test to detect effect of miR-143 on migration of E6-1 cells

图4 Transwell试验检测miR-143对E6-1细胞侵袭能力的影响Fig.4 Transwell test to detect effect of miR-143 on invasion of E6-1 cells

3 讨论

B细胞淋巴瘤是一种由多种因素引起的血液系统发病率较高的恶性肿瘤[9]。由于目前早期诊断和发现水平存在一定缺陷，早期B细胞淋巴瘤的诊断尚未达到较高的水平，对B细胞淋巴瘤的诊断和治疗预后都存在不利的影响[10,11]。随着医学分子生物学和基因检测技术的不断发展，B细胞淋巴瘤的分子标志物和治疗靶标获得越来越多的关注，通过检测B细胞淋巴瘤的临床分子靶标，然后根据不同标记物的情况对B细胞淋巴瘤患者进行早期诊断和个体治疗是未来发展的热门方向[12]。

miRNA是广泛存在于哺乳动物细胞中的一种短序列的非编码RNA因子，可以调控基因表达和转录过程[13]。在哺乳动物中，miRNA一般是由21～24个核苷酸组成，通过与下游相关靶点形成复合物，来调控基因的翻译过程或诱导靶向mRNA的降解过程[14]。新的证据表明，miRNA在多种肿瘤细胞的发展进程中起关键作用，包括细胞分化、增殖、凋亡、应激反应、脂肪代谢、肿瘤发生和转移等[15-17]。最近，部分miRNA在肿瘤中报道可以促进或抑制恶性肿瘤细胞的转移侵袭行为，为研究肿瘤细胞转移的过程提供了新的视角[18]。

有研究表明，某些mRNA在B细胞淋巴瘤的发生发展过程中有一定的诱导或抑制作用[19]。因此，我们推测在B细胞淋巴瘤细胞的致癌过程中诱导miRNA的表达可能阻断恶性肿瘤细胞的快速转移与侵袭过程。虽然在胃癌、肝癌等实体肿瘤中已经报道了miR-143水平存在一定的表达异常，但是B细胞淋巴瘤尚未有明确报道[20,21]。在本报告中，我们首次研究并选择出高侵袭性的B细胞淋巴瘤细胞，通过选择的优良B细胞淋巴瘤转移细胞株模型进行后续实验探索。

miR-143的抗转移功能让人联想到与P53肿瘤抑制因子的作用功能相似[22]。通过激活肿瘤抑制因子对各种致癌信号做出相应反应，致癌作用可能是通过诱导B细胞淋巴瘤中miR-143的表达影响B细胞淋巴瘤细胞的行为反应，但是其具体的分子通路机制还需要进一步的研究进行探讨及验证。

我们实验通过检测miR-143在B细胞淋巴瘤细胞株中的表达，发现miR-143在B细胞淋巴瘤细胞中可能扮演着抑癌因子的作用，并通过生物信息学检测寻找miR-143下游的蛋白靶点PAN3。通过增加miR-143的表达检测B细胞淋巴瘤细胞的生物学行为的变化，推测miR-143可以抑制B细胞淋巴瘤细胞的增殖和侵袭，从而调控其在生物体内的转移行为。另外，我们通过查阅文献发现，miR-143在乳腺癌细胞株中可以抑制Akt的磷酸化水平，减弱乳腺癌细胞的迁移和侵袭细胞的存活率[23]。但是在B细胞淋巴瘤细胞中我们还未检测相关蛋白通路的磷酸化水平，还不清楚miR-143是否通过信号通路激活抑制B细胞淋巴瘤细胞的转移。

在之前的研究中，有研究报道PAN3广泛存在于各种侵袭性肿瘤细胞株中，在非侵袭性的肿瘤细胞株中的表达水平较低，表明PAN3可能在肿瘤细胞中起到促癌因子的作用[24]。而miR-143则在B细胞淋巴瘤细胞株中的表达与PAN3的表达相反。当我们转染miR-143-mimic和miR-143-inhibitor后，双向证明其可以影响B细胞淋巴瘤细胞的增殖和侵袭能力，通过双荧光素酶试验我们知道PAN3的表达受miR-143的调控，但是PAN3能否逆向影响miR-143的抑癌作用，本实验尚未进行完善探讨，拟后续试验继续检测PAN3蛋白的过表达和敲除是否可以逆转miR-143对B细胞淋巴瘤细胞的抑制作用。然而有其他学者研究报道，通过慢病毒敲除PAN3蛋白的表达与过表达miR-143对肿瘤细胞的影响程度类似，都对肿瘤细胞的增殖和转移具有一定的抑制作用，但是通过慢病毒敲除PAN3的影响效应相对较弱。我们推测这可能是因为miR-143下游的相关靶标不止PAN3，尽管如此，仍可以表明miR-143对肿瘤细胞的抑制作用，至少部分是通过调控PAN3的表达实现的。

总之，我们通过研究miR-143与下游PAN3靶点相互作用对B细胞淋巴瘤细胞的增殖和侵袭能力的影响证实了我们对miR-143调控作用的猜测，补充了miR-143在B细胞淋巴瘤中的生物信息学的调控方式。为B细胞淋巴瘤的临床早期诊断和治疗提供一定的分子理论支持，可以通过使用miR-143的类似物激活其表达来达到治疗效果。后续我们继续完善相关机制的研究为miR-143在B细胞淋巴瘤中的作用机制提供更多的理论支持。

[1] Llosa NJ,Cruise M,Tam A,etal.The vigorous immune microenvironment of microsatellite instable colon cancer is balanced by multiple counter-inhibitory checkpoints[J].Cancer Discov,2015,5(1):43-51.

[2] 刘见荣,侯风刚.B细胞淋巴瘤治疗概况[J].辽宁中医药大学学报,2014,16(2):99-101.

[3] Chen CYA,Chang JT,Ho YF,etal.MiR-143 down-regulates TNF-α/NF-κB signalling and IL-6 expression by silencing HMGA1 and MALT1[J].Nucleic Acids Res,2016，44(8)：3772-3787.

[4] 马俊丽,曾 珊.错配修复基因和B细胞淋巴瘤的关系[J].中南大学学报(医学版),2014,2:17.

[5] Icli B,Dorbala P,Feinberg MW.An emerging role for the miR-143 family in cardiovascular disease[J].Trends Cardiovascular Med,2014,24(6):241-248.

[6] Eguchi A,Du Jeu XDM,Johnson CD,etal.Liver PAN3 suppression for treatment of fibrosis associated with non-alcoholic steatohepatitis[J].J Hepatol,2016,64(3):699-707.

[7] 陈 昊,陈乃玲,白 玲,等.促凋亡蛋白 FasL,PAN3 在B细胞淋巴瘤组织表达的临床意义[J].中国实验诊断学,2008,12(6):757-759.

[8] Brasacchio D,Noori T,House C,etal.A functional genomics screen identifies PCAF and ADA3 as regulators of human granzyme B-mediated apoptosis and PAN3 cleavage[J].Cell Death Different,2014,21(5):748-760.

[9] Schetter AJ,Leung SY,Sohn JJ,etal.MicroRNA expression profiles associated with prognosis and therapeutic outcome in colon adenocarcinoma[J].JAMA,2008,299(4):425-436.

[10] Kyu HH,Bachman VF,Alexander LT,etal.Physical activity and risk of breast cancer,colon cancer,diabetes,ischemic heart disease,and ischemic stroke events:systematic review and dose-response meta-analysis for the Global Burden of Disease Study 2013[J].BMJ,2016,354:i3857.

[11] Felipe De Sousa EM,Wang X,Jansen M,etal.Poor-prognosis colon cancer is defined by a molecularly distinct subtype and develops from serrated precursor lesions[J].Nat Med,2013,19(5):614-618.

[12] Cayrefourcq L,Mazard T,Joosse S,etal.Establishment and characterization of a cell line from human circulating colon cancer cells[J].Cancer Res,2015,75(5):892-901.

[13] Kichev A,Rousset CI,Baburamani AA,etal.Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) signaling and cell death in the immature central nervous system after hypoxia-ischemia and inflammation[J].J Biological Chem,2014,289(13):9430-9439.

[14] 张有成,王 杉,张 辉,等.选择性环氧化酶-2 抑制剂 NS-398 抗B细胞淋巴瘤机制及对 5-氟尿嘧啶化疗的辅助作用[J].中华医学杂志,2004,84(7):583-586.

[15] Dalerba P,Sahoo D,Paik S,etal.CDX2 as a prognostic biomarker in stage II and stage III colon cancer[J].New England J Med,2016,374(3):211-222.

[16] Shen M,Wu M Y,Chen L P,etal.Cantharidin represses invasion of pancreatic cancer cells through accelerated degradation of MMP2 mRNA[J].Sci Rep,2015,5：11836.

[17] Allen KM,Purves-Tyson TD,Fung SJ,etal.The effect of adolescent testosterone on hippocampal BDNF and TrkB mRNA expression:relationship with cell proliferation[J].BMC Neuroscience,2015,16(1):4.

[18] Feng G,Shi H,Li J,etal.MiR-30e suppresses proliferation of hepatoma cells via targeting prolyl 4-hydroxylase subunit alpha-1(P4HA1)mRNA[J].Biochem Biophysical Res Communicat,2016,472(3):516-522.

[19] del Reino P,Alsina-Beauchamp D,Escós A,etal.Pro-oncogenic role of alternative p38 mitogen-activated protein kinases p38γ and p38δ,linking inflammation and cancer in colitis-associated colon cancer[J].Cancer Res,2014,74(21):6150-6160.

[20] El-Ahwany E,Nagy F,Zoheiry M,etal.Circulating miRNAs as predictor markers for activation of hepatic stellate cells and progression of HCV-induced liver fibrosis[J].Electronic Physician,2016,8(1):1804.

[21] Callegari E,Gramantieri L,Domenicali M,etal.MicroRNAs in liver cancer:a model for investigating pathogenesis and novel therapeutic approaches[J].Cell Death Different,2015,22(1):46-57.

[22] Fesler A,Zhang N,Ju J.The expanding regulatory universe of p53 in gastrointestinal cancer[J].F1000Res,2016,5：756.

[23] Palumbo T,Faucz FR,Azevedo M,etal.Functional screen analysis reveals miR-143b and miR-128 as central regulators of pituitary somatomammotrophic tumor growth through activation of the PTEN-AKT pathway[J].Oncogene,2013,32(13):1651-1659.

[24] Wree A,Johnson CD,Font-Burgada J,etal.Hepatocyte-specific PAN3 depletion reduces tumor development by suppressing inflammation-related compensatory proliferation[J].Cell Death Different,2015,22(12):1985-1994.

EffectsofmiR-143oninvasionandmigrationofBcelllymphomacellsthroughregulatingexpressionofPAN3protein

YANGMan,WUSun,ZHANGLing-Xiu,HUANGYan,ZIYou-Mei,ZHANGYuan.

DepartmentofHematology,FirstAffiliatedHospitalofXinxiangMedicalCollege,Weihui453100，China

Objective:To investigate the effect of miR-143 on the invasion and migration of B cell lymphoma cells.MethodsThe expression of miR-143 in normal bone marrow and lymphoma was detected by qPCR.The expression levels of miR-143 in different cell lines were examined by qPCR.qPCR was used to detect the ability of miR-143 on PAN3.The relationship between miR-143 and PAN3 was detected by double luciferase assay.The effect of miR-143 expression on the migration ability of B cell lymphoma E6-1 cells was examined by scratch test.The effect of miR-143 expression on the invasion ability of B cell lymphoma E6-1 cells was exa mined by transwell test.ResultsCompared with normal bone marrow,miR-143 was down-regulated in B-cell lymphoma.Double luciferase assay showed that miR-143 could regulate the expression of PAN3.Overexpression of miR-143,E6-1 cells significantly reduced the ability to attack and migrate.ConclusionmiR-143 can regulate the migration and invasion of B cell lymphoma cells by regulating the expression of PAN3.

miR-143；Lymphoma；PAN3；Transwell

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.12.004

R733.4

A

1000-484X(2017)12-1774-05

①本文为河南省教育厅基金资助项目(No.2006320039)。

杨 满(1983年-)，女，硕士，主治医师，主要从事血液病学方面的研究，E-mail：mmyis2017@126.com。

[收稿2017-05-15 修回2017-06-19]

(编辑 许四平 刘格格)