HPLC法同时测定大黄-黄连药材中5种蒽醌类成分的含量及最优配伍研究

王有森，王智亮（潍坊市人民医院药剂科，山东潍坊261599）

HPLC法同时测定大黄-黄连药材中5种蒽醌类成分的含量及最优配伍研究

王有森＊，王智亮（潍坊市人民医院药剂科，山东潍坊261599）

目的：建立同时测定大黄-黄连药材中5种蒽醌类成分含量的方法，并优选大黄-黄连药材质量比。方法：采用高效液相色谱法。色谱柱为Zorbax SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为乙腈-0.05 mol/L磷酸二氢钾（48∶52，V/V，每100 mL中加十二烷基硫酸钠0.4 g，磷酸调节pH至4.0），流速为1 mL/min，检测波长为254 nm，柱温为25℃，进样量为10 μL。考察大黄-黄连药材质量比为1∶1、1∶2、2∶1、2∶3、3∶2时配伍药材中芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的含量。结果：芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚进样量分别在0.652～3.081、0.704～3.422、1.280～6.197、0.633～0.324、1.326～5.954 μg范围内与各自峰面积积分值呈良好线性关系（r≥0.999 7），精密度、稳定性、重复性试验的RSD均小于2.0%（n＝6），平均加样回收率为98.92%～100.37%（RSD≤2.26%，n＝6）。大黄-黄连药材质量比为2∶1时，5种蒽醌类成分总量最高。结论：本方法精密度、稳定性、重复性良好，可用于不同配伍比大黄-黄连药材的质量检定；大黄-黄连药材的最佳质量比为2∶1。

大黄；黄连；配伍；蒽醌类成分；高效液相色谱法

大黄黄连泻心汤源自张仲景的《伤寒杂病论》，注有“心下痞，按之濡，其脉关上浮者，大黄黄连泻心汤主之”[1]。现代药理研究表明，大黄黄连泻心汤具有调血脂、抗菌、增强机体免疫功能、抗消化性溃疡等作用[2-4]。该方由大黄2两、黄连1两合煎而成，即大黄-黄连药材的质量比为2∶1，但这是否是其有效成分的最佳比例尚不得而知。因此，笔者以高效液相色谱（HPLC）法测定大黄-黄连药材不同配伍下蒽醌类成分（芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚）的含量[5-7]，以多种成分指标综合评价大黄黄连泻心汤加减方，为其质量标准的控制提供参考。

1 材料

1.1 仪器

1100型HPLC仪，包括二极管阵列检测器（美国Agilent公司）；KQ-500GVDV型超声清洗仪（昆山超声仪器有限公司）；BS224S型分析天平（德国Satorius公司）；MF10型粉碎机（德国IKA公司）。

1.2 药材与试剂

大黄、黄连药材购自安徽亳州，经潍坊市人民医院药剂科王智亮主管药师鉴定，均符合2015年《中国药典》（一部）相关规定。芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110795-201305、110757-201302、110756-201210、110796-201101、110758-201206，纯度：＞98%）；甲醇为色谱纯，其他试剂为分析纯，水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Zorbax SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-0.05 mol/L磷酸二氢钾（48∶52，V/V，每100 mL中加十二烷基硫酸钠0.4 g，磷酸调节pH至4.0）；流速：1 mL/min；检测波长：254 nm；柱温：25℃；进样量：10 μL[8-10]。

2.2 溶液的制备

2.2.1 供试品溶液的制备按“2.9”项下质量比称取大黄-黄连药材共约0.2 g，精密称定，加入甲醇20 mL，称定质量，超声（功率：250 W，频率：40 kHz，下同）40 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，即得供试品溶液。

2.2.2 混合对照品溶液的制备取减压干燥至恒质量的芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚对照品适量，以甲醇溶解，超声20 min，制得芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚质量浓度分别为0.124 8、0.135 2、0.250 7、0.126 7、0.264 5 mg/mL的混合对照品溶液。

2.3 专属性试验

取供试品溶液、混合对照品溶液各10 μL，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图。结果，芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚出峰处未见其他干扰峰；芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚分离度大于2，且以芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚峰理论板数计大于4 000。色谱图见图1。

图1 高效液相色谱图Fig 1HPLC chromatograms

2.4 线性关系考察

取混合对照品溶液5、10、15、20、25 μL，按“2.1”项下色谱条件进样测定。以芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚进样量为横坐标（x，μg）、峰面积积分值为纵坐标（y）进行线性回归分析，得回归方程、线性范围见表1。

表1 回归方程与线性范围Tab 1Regression equation and linear range

由表1可知，芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚在各自进样量范围内与峰面积积分值呈良好的线性关系。

2.5 精密度试验

量取混合对照品溶液10μL，按“2.1”项下色谱条件进样测定6次。结果，芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚峰面积的RSD分别为1.24%、0.86%、0.73%、1.09%、0.86%（n＝6），表明本试验精密度良好。

2.6 稳定性试验

取供试品溶液，于室温下放置0、2、4、6、8、10 h时，按“2.1”项下色谱条件进样测定6次。结果，芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚峰面积的RSD分别为0.98%、0.85%、1.32%、1.16%、0.92%（n＝6），表明供试品溶液在室温下放置10 h内稳定。

2.7 重复性试验

取大黄、黄连适量，按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定6次。结果，芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚含量的RSD分别为1.48%、1.86%、1.25%、1.19%、1.07%（n＝6），表明本试验重复性良好。

2.8 加样回收率试验

取已知含量的大黄-黄连样品（质量比为2∶1），共6份，加入芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚对照品溶液（0.124 8、0.135 2、0.250 7、0.126 7、0.264 5 mg/mL）适量，按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，计算加样回收率，结果见表2。

2.9 样品中蒽醌类成分的含量测定

制备大黄-黄连药材质量比分别为1∶1、1∶2、2∶1、2∶3、3∶2的样品，按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定蒽醌类成分的含量，结果见表3。

3 讨论

大黄、黄连二药，味苦性寒、直折火势，是治疗各种火证的主药。黄连解毒汤、大黄汤、栀子金花汤、三补丸、大金花丸、清心丸、既济解毒汤、人中黄丸、当归龙荟丸等泻火之剂，其实都是在大黄黄连泻心汤基础上，据证加减而成。《金匮要略》中提到大黄泻心汤可“急泻三阳实火”，大黄中蒽醌类成分的作用就是泄下[11]，黄连中生物碱作用为抑菌[12-13]，因此本文考察重点为蒽醌类成分。

表2 加样回收率试验结果（n＝6）Tab 2Results of recovery test（n＝6）

表3 含量测定结果（n＝3，mg/g）Tab 3Result of content determination（n＝3，mg/g）

供试品溶液的制备中比较了超声和回流提取法，结果超声提取效果明显且操作简单、方便，用时较短，故采用超声提取法。超声提取法是采用超声波辅助溶剂进行提取，通过破坏植物药材的细胞，使溶剂渗透到药材细胞中，可缩短提取时间、提高提取率，多用于小型生产或实验。超声提取与药材实际运用中的煎煮提取都是属于物理提取，但超声提取较煎煮提取药材有效成分含量多，由于各指标成分在超声或煎煮中提取条件一致，因此各成分含量比例一致[14-16]。笔者为了让各药对中各指标成分在短时间内含量结果差异更明显，因此采用超声提取法，这也是试验中采取的通用方法。笔者在预试验中考察了不同超声时间下，不同百分比甲醇、乙醇的超声效果，结果表明各指标成分在甲醇中超声40 min提取率较高。

2015年版《中国药典》（一部）中大黄和三黄片等含大黄的制剂中蒽醌类成分含量测定检测波长均为254 nm[17]，实验对5种成分进行200～400 nm全波长扫描，测得最大吸收峰均为（250±5）nm，因此选择检测波长为254 nm。

由含量测定结果可知，当大黄-黄连药材质量比为1∶1时，蒽醌类成分含量最低；随着黄连的比例降低，蒽醌类成分逐渐增加。这可能是由于大黄-黄连配伍时，黄连主要成分生物碱与酸性的蒽醌类发生沉淀作用，使得大黄蒽醌类成分减少。由于该方中大黄和黄连均为主要组成，因此不宜过多减少黄连比例，故本试验未考察大黄-黄连质量比超过3∶1的配比[18-20]。

综上所述，本方法操作简便，可用于大黄-黄连不同配伍下蒽醌类成分的含量测定。在一定范围内，适当增加大黄配比，可增加蒽醌类成分含量。

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Simultaneous Content Determination of 5 Anthraquinones of Rhei Radix-coptidis Rhizoma by HPLC and Study on the Optimal Compatibility

WANG Yousen，WANG Zhiliang（Dept.of Pharmacy，Weifang People’s Hospital，Shandong Weifang 261599，China）

OBJECTIVE：To establish a method for the simultaneous content determination 5 anthraquinones of rhei radix-coptidis rhizoma，and optimize its best mass ratio.METHODS：HPLC was performed on the column of Zorbax SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）with mobile phase of acetonitrile-0.05 mol/L potassium dihydrogen phosphate（48∶52，V/V，adding sodium dodecyl sulfate 0.4 g per 100 mL，pH value was adjusted to 4.0）；detection wavelength was 254 nm；flow rate was 1 mL/min；column temperature was 25℃；and injection volume was 10 μL.When mass ratio of rhei radix-coptidis rhizoma was 1∶1，1∶2，2∶1，2∶3，3∶2，the contents of aloe emodin，rhein，emodin，chrysophanol and emodin ether were investigated.RESULTS：The aloe emodin，rhein，emodin，chrysophanol and emodin ether showed good linear relationship with peak area in the range of 0.652-3.081，0.704-3.422，1.280-6.197，0.633-0.324，1.326-5.954 μg（r≥0.999 7）；RSDs of precision，stability，reproducibility tests were lower than 2.0%（n＝6）；and average recovery was 98.92%-100.37%（RSD≤2.26%，n＝6）.When mass ratio was 2∶1，the total contents of 5 ingredients were the highest.CONCLUSIONS：The method has good precision，stability，reproducibility，and can be used for the quality verification of rhei radix-coptidis rhizoma under different compatibilities.The best mass ratio of rhei radixcoptidis rhizoma is 2∶1.

Rhei radix；Coptidis rhizoma；Compatibility；Anthraquinones；HPLC

R943.1

A

1001-0408（2017）34-4818-04

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.34.17

＊主任药师。研究方向：医院药学。电话：0536-8234981。E-mail：wfwys666@163.com

2017-08-22

2017-10-07）

（编辑：刘明伟）