二氢杨梅素对高糖诱导的肾小球系膜细胞增殖及纤维连接蛋白堆积的影响Δ

李加林，郭小华，吴艳娇，黄志伟，刘思齐，吴素珍（.赣南医学院药学院，江西赣州34000；2.赣南医学院基础医学院，江西赣州34000）

二氢杨梅素对高糖诱导的肾小球系膜细胞增殖及纤维连接蛋白堆积的影响Δ

李加林1＊，郭小华1，吴艳娇1，黄志伟1，刘思齐1，吴素珍2#（1.赣南医学院药学院，江西赣州341000；2.赣南医学院基础医学院，江西赣州341000）

目的：研究二氢杨梅素（DMY）对高糖（HG）诱导的肾小球系膜细胞（MCs）的增殖及纤维连接蛋白（FN）堆积的影响，探讨其对糖尿病肾病肾小球硬化的作用机制。方法：将细胞分为正常组（5.5 mmol/L葡萄糖）、HG组（30 mmol/L葡萄糖）和DMY低、中、高浓度组（30 mmol/L葡萄糖+22.5、45、90 μmol/L DMY），培养48 h后采用MTT法检测细胞的增殖活性[以光密度（OD）值反映]；采用分子对接法对DMY与Smad2的结合状态进行模拟分析；将细胞分为正常组（5.5 mmol/L葡萄糖）、HG组（30 mmol/L葡萄糖）、DMY组（30 mmol/L葡萄糖+45 μmol/L DMY）和DMY对照组（5.5 mmol/L葡萄糖+45 μmol/L DMY），培养5 h后采用Western blot法检测细胞中磷酸化Smad2（p-Smad2）及细胞外基质蛋白FN的表达水平。结果：MTT检测结果显示，与正常组比较，HG组细胞的OD值显著升高（P＜0.05）；与HG组比较，DMY各浓度组细胞的OD值均显著降低（P＜0.05）。DMY与Smad2蛋白分子结合的吉布斯自由能（ΔG）为－5.64 kJ/mol，抑制常数Ki为73.53 μmol/L，在第465、464、461、458这4个氨基酸残基位点有氢键供体与受体的结合。Western blot结果显示，与正常组比较，HG组细胞中p-Smad2及细胞外基质蛋白FN表达水平均显著升高（P＜0.05）；与HG组比较，DMY组细胞中p-Smad2及细胞外基质蛋白FN表达水平显著降低（P＜0.05）。结论：DMY可抑制HG诱导的MCs增殖，并通过与Smad2结合，抑制Smad2的磷酸化，继而降低细胞外基质蛋白FN的表达，从而改善糖尿病肾病肾小球硬化。

二氢杨梅素；肾小球系膜细胞；增殖；纤维连接蛋白；分子对接

糖尿病伴有的长期高血糖常会使糖尿病患者发生全身性脏器组织损害，形成慢性并发症，其中糖尿病肾病（Diabetic kidney disease，DKD）是糖尿病发展过程中出现的常见而难治的微血管并发症。DKD主要病理特征是系膜细胞增生，系膜区细胞外基质（Extracellu-lar matrix，ECM），特别是纤维连接蛋白（Fibronectin，FN）过度堆积，是导致终末期肾疾病的主要因素[1-4]。目前临床治疗也只能延缓DKD的发生和减慢其发展进程，并不能达到拮抗或逆转肾病变的目的，因此迫切需要寻找新的治疗DKD的药物。

藤茶来源于葡萄科蛇葡萄属显齿蛇葡萄[Ampelopsis grossedentata（Hand.-Mazz.）WT.Wang]，多生长在我国南方，主要分布在湖北、湖南、江西、福建等地，在民间作为药食两用的植物，已经有数百年的历史[5]。葡萄科蛇葡萄属的植物中一个比较有特征性的成分就是二氢杨梅素（Dihydromyricetin，DMY），其中藤茶的DMY含量高达29%[6]。文献报道DMY能够降血糖[7-8]、调节机体的糖耐受量。另外，还有研究发现DMY可以减轻DKD大鼠肾小球硬化[9]，但到目前为止，尚无人报道其抗DKD肾小球硬化的机制。转化生长因子β（Transforming growth factor beta signaling，TGF-β）/Smads信号通路在DKD动物模型和细胞模型中均被激活，其中Smad2磷酸化水平升高是TGF-β/Smads信号通路激活的一个重要节点[10-11]。抑制TGF-β/Smads信号通路激活可以延缓DKD的进程，Smad2是TGF-β/Smads信号通路下游一个重要的信号分子，笔者推测DMY可能是通过抑制TGF-β/Smads信号通路对DKD起保护作用的。因此，笔者首先采用分子对接法从理论水平分析DMY与Smad2有结合位点，从而推测DMY能够抑制Smad2的活化。然后采用细胞试验进一步验证DMY能够抑制高糖（HG）环境下肾小球系膜细胞（MCs）中Smad2磷酸化，进而抑制FN的表达，为将DMY开发成治疗DKD药物奠定实验基础。

1 材料

1.1 仪器

1510酶标仪[赛默飞世尔（上海）仪器有限公司]；GBOX Chemi XRQ荧光化学发光凝胶成像系统（英国Syngene公司）；二氧化碳（CO2）细胞培养箱（美国Thermo公司）。

1.2 药品与试剂

DMY（赣南医学院药学院自制，批号：20160706，经高效液相色谱法测定其纯度＞95%）；胎牛血清、DMEM培养基（美国Gibco公司）；二甲基亚砜（DMSO）、MTT（美国Sigma公司）；兔抗大鼠磷酸化Smad2（p-Smad2）一抗（美国CST公司）；小鼠抗大鼠FN抗体（美国BD Biosciences公司）；小鼠抗大鼠β-肌动蛋白（β-actin）一抗、辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔二抗、HRP标记的山羊抗鼠二抗（美国Santa Cruz公司）；电化学发光（ECL）液（美国Thermo公司）；二辛可宁酸（BCA）蛋白浓度测定试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；其他化学试剂为国产分析纯。

1.3 动物

清洁级SD大鼠，♂，体质量200～220 g，购于赣南医学院动物实验中心，生产合格证号：SCXK（赣）2014-0001。

2 方法

2.1 细胞培养

取正常成年SD大鼠，在无菌条件下取出肾组织，去除肾包膜，采用分样筛法分离出肾小球，通过优生选择法进行MCs分离，经免疫荧光细胞化学技术鉴定，原代系膜细胞平滑肌肌动蛋白（α-SMA）抗体免疫荧光染色呈阳性，去氧肾上腺素（Nephrin）抗体间接免疫荧光呈阴性[12-13]。将原代培养的MCs置于含20%胎牛血清的DMEM培养液中，置于饱和湿度、37℃、含5%CO2的培养箱内静置培养，2～3 d换1次培养基。本研究采用6～16代MCs进行试验。

2.2 MTT法检测DMY对HG刺激的MCs增殖的影响

取对数生长期的MCs，制成密度为1.0×105mL－1的细胞悬液，以每孔180 μL接种于96孔培养板中，在37℃、5%CO2条件下培养24 h。然后将细胞分为正常组（5.5 mmol/L葡萄糖）、HG组（30 mmol/L葡萄糖）、DMY低浓度组（30 mmol/L葡萄糖+22.5 μmol/L DMY）、DMY中浓度组（30 mmol/L葡萄糖+45 μmol/L DMY）、DMY高浓度组（30 mmol/L葡萄糖+90 μmol/L DMY）。培养48 h后，向96孔板内加入20 μL的MTT溶液（5 mg/mL），继续培养4 h，然后去掉培养液，向各孔中加入150 μL的DMSO，待蓝色结晶物完全溶解后，用酶标仪测量各孔的光密度（OD）值，测定波长为570 nm。细胞存活率（%）＝试验组OD值/正常组OD值×100%。

2.3 分子对接法分析DMY与Smad2的结合情况

首先采用ISIS Draw软件来绘制DMY配体的2D结构，再运用Online Demos VIEWDD软件转化成3D结构，保存为配体PDB文件。然后下载PDB受体文件，通过应用Chimera软件来删除非核心区肽链和原有配体及水分子，从而得到简化后的PDB受体文件。然后准备对接文件，首先打开AutoDock Tools软件生成配体PDBQT文件及受体PDBQT文件，再运用Python来修改受体PDBQT文件中错误的电荷参数，接着运用AutoDock Tools软件对上述2个文件设定对接模式参数和对接网格，获得DPF文件及GPF文件。用AutoGrid 4软件使GPF文件生成相应的Map对接文件，再用AutoGrid 4软件将其中的DPF文件与由GPF文件生成Map文件进行对接计算得到DLG数据文件，用AutoDock Tools软件分析DLG数据文件，得到吉布斯自由能（ΔG）及抑制常数Ki等相关分子对接数据。当ΔG≤0，说明配体与受体容易结合，且ΔG越小分子间的结合越稳定；Ki值越小说明配体与受体结合能力越强。

2.4 Western blot法检测细胞中Smad2的磷酸化水平与细胞外基质蛋白FN的表达

取对数生长期的MCs，制成密度为1.0×105mL－1的细胞悬液，按每皿2 mL接种于直径为6 cm的细胞培养皿中，置入37℃、5%CO2的培养箱培养，待细胞达到80%融合时，换无血清DMEM培养液继续培养24 h，使细胞生长同步化。然后将细胞分为正常组（5.5 mmol/L葡萄糖）、HG组（30 mmol/L葡萄糖）、DMY组（30 mmol/L葡萄糖+45 μmol/L DMY）和DMY对照组（5.5 mmol/L葡萄糖+45 μmol/L DMY），每组设6个复孔。继续培养5 h后，在培养皿中加入细胞裂解液120 μL，然后置于4℃冰箱中裂解10 min。用细胞刮刷将细胞刮下，将其吸入EP管中后置于离心半径为8 cm的冷冻离心机中离心（1 2000 r/min）10 min，收集上清。采用十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离样品中的蛋白成分，各泳道蛋白上样量为50 μg。再将凝胶上的蛋白转印到0.45 μm硝酸纤维素膜（NC膜）上，5%脱脂奶粉封闭，然后与一抗4℃孵育过夜，TBST洗膜后再与HRP标记的二抗室温孵育2 h，TBST再次洗膜。ECL检测免疫印迹信号，用灰度值表示蛋白表达量。将正常组蛋白表达量的灰度值看作1，其他组相应蛋白灰度值和正常组蛋白灰度值的比值就是该蛋白量。

2.5 统计学方法

采用SPSS 21.0统计学软件对所得结果进行统计分析。计量资料以±s表示，多个样本均数之间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用t检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 DMY对HG环境下MCs增殖的影响

与正常组比较，HG组细胞的OD值显著升高（P＜0.05），说明HG能够诱导MCs增殖。与HG组比较，DMY各浓度组细胞的OD值均显著降低（P＜0.05），且呈浓度效应关系，可见DMY可明显抑制HG诱导的MCs增殖，结果见表1。

表1 DMY对系膜细胞增殖的影响（±s，n＝6）Tab 1Effect of DMY on the proliferation of glomerular mesangial cells（±s，n＝6）

表1 DMY对系膜细胞增殖的影响（±s，n＝6）Tab 1Effect of DMY on the proliferation of glomerular mesangial cells（±s，n＝6）

注：与正常组比较，＊P＜0.05；与HG组比较，#P＜0.05Note：vs.normal group，＊P＜0.05；vs.HG group，#P＜0.05

细胞存活率，%100.00 128.81 72.03 45.34 39.62组别正常组HG组DMY低浓度组DMY中浓度组DMY高浓度组OD值0.472±0.083 0.608±0.105＊0.340±0.041#0.214±0.037#0.187±0.015#

3.2 DMY与Smad2的分子对接数据

通过运用计算机软件进行计算并模拟分析，得到配体DMY与Smad2蛋白分子结合的ΔG为－5.64 kJ/mol，Ki为73.53 μmol/L。当ΔG≤0，配体与受体的结合会比较容易，且其数值与结合倾向的稳定性呈负相关。在图1三维结合模拟中，笔者也发现配体化合物DMY与其模拟结合的蛋白（Smad2）在第465、464、461、458这4个氨基酸残基位点有氢键供体与受体的结合。DMY与Smad2蛋白的分子对接立体空间示意图见图1。

图1 DMY与Smad2蛋白的分子对接立体空间示意图Fig1Moleculardockingthree-dimensional space diagram of DMY with Smad2 protein

3.3 DMY对HG环境下细胞中p-Smad2及细胞外基质蛋白FN表达的影响

与正常组比较，HG组细胞中p-Smad2及细胞外基质蛋白FN表达水平显著升高（P＜0.05），DMY对照组细胞中p-Smad2及细胞外基质蛋白FN表达水平差异无统计学意义（P＞0.05），说明HG能够诱导MCs中Smad2的磷酸化及细胞外基质蛋白FN表达上调。与HG组比较，DMY组细胞中p-Smad2及细胞外基质蛋白FN表达水平显著降低（P＜0.05），说明DMY能够显著抑制HG诱导的MCs中Smad2的磷酸化及细胞外基质蛋白FN表达上调。DMY对照组和正常组比较，细胞中p-Smad2及细胞外基质蛋白FN表达水平差异无统计学意义（P＞0.05），说明DMY对正常MCs中Smad2磷酸化及细胞外基质蛋白FN表达没有明显影响，结果见图2、图3。

图2 各组细胞中p-Smad2及细胞外基质蛋白FN表达的电泳图Fig2Electrophoresischartsofexpressions ofp-Smad2andextracellularmatrix protein FN in each group

4 讨论

DKD的主要病理学表现为肾体积增大，肾小球基底膜增厚，系膜细胞增生、肥大及系膜区ECM进行性积聚。FN是TGF-β/Smads信号通路下游的一个重要靶蛋白，也是ECM的主要组成成分之一，在DKD动物模型中表达会显著增加，是DKD肾小球硬化主要指标之一[14-16]。本研究通过MTT试验发现，低、中、高浓度DMY均能够显著抑制HG诱导的MCs增殖。

TGF-β/Smads信号通路是肾纤维化的一个经典的信号通路，在糖尿病大鼠和HG刺激的系膜细胞中该通路是异常激活的，其激活可诱导肾小球和肾小管的细胞肥大，介导足细胞损伤，促进系膜细胞增生、基底膜增厚，以及促进肾间质纤维化，是发病机制的最后共同通路，因而通过抑制TGF-β/Smads信号通路可以减缓DKD的进程[17-20]。而Smad2是TGF-β/Smads信号通路下游的一个重要信号分子，TGF-β主要是通过调节其下游的Smad2和Smad3的磷酸化来发挥生物学功能[21]。本研究结果发现，DMY能够抑制HG诱导下MCs中Smad2的磷酸化与细胞外基质蛋白FN的表达。

综上所述，本研究结果表明，DMY可能是通过与Smad2结合，抑制了Smad2的磷酸化，抑制了DKD大鼠MCs中TGF-β/Smads信号通路激活，继而影响MCs中FN的堆积，从而改善DKD的肾小球硬化。

图3 各组细胞中p-Smad2及细胞外基质蛋白FN表达的测定结果Fig 3Determination results of protein expressions of p-Smad2 and extracellular matrix protein FN in each group

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Effect of Dihydromyricetin on High Glucose-induced Glomerular Mesangial Cell Proliferation and Fibronectin Accumulation

LI Jialin1，GUO Xiaohua1，WU Yanjiao1，HUANG Zhiwei1，LIU Siqi1，WU Suzhen2（1.School of Pharmacy，Gannan Medical University，Jiangxi Ganzhou 341000，China；2.School of Basic Medicine，Gannan Medical University，Jiangxi Ganzhou 341000，China）

OBJECTIVE：To study the effect of dihydromyricetin（DMY）on high glucose（HG）-induced glomerular mesangial cell（MCs）proliferation and fibronectin（FN）accumulation，and explore its mechanism for diabetic nephropathy glomerulosclerosis.METHODS：Cells were divided into normal group（5.5 mmol/L glucose），HG group（30 mmol/L glucose），DMY low-concentration，medium-concentration，high-concentration groups（30 mmol/L glucose+22.5，45，90 μmol/L DMY）.After incubating 48 h，MTT was used to detect the proliferative activity[reflected by the optical density（OD）value]of cells；molecular docking method was adopted to conduct simulation analysis for DMY binding state with Smad2.Cells were divided into normal group（5.5 mmol/L glucose），HG group（30 mmol/L glucose），DMY group（30 mmol/L glucose+45 μmol/L DMY）and DMY control group（5.5 mmol/L glucose+45 μmol/L DMY）.After incubating 5 h，Western blot was used to detect the expression levels of phosphorylated Smad2（p-Smad2）and extracellular matrix protein FN.RESULTS：Results of MTT detection showed，compared with normal group，OD values in HG group were significantly increased（P＜0.05）；compared with HG group，OD values in DMY each concentration group were significantly reduced（P＜0.05）.The Gibbs free energy（ΔG）of DMY and Smad2 protein was－5.64 kJ/mol，Kiwas 73.53 μmol/L，and there were hydrogen bond donor and receptor binding in No.465，464，461，458 amino acid residues.Results of Western blot showed，compared with normal group，expression levels of p-Smad2 and extracellular matrix protein FN in HG group were significantly increased（P＜0.05）；compared with HG group，expression levels of p-Smad2 and extracellular matrix protein FN in DMY group were significantly decreased（P＜0.05）.CONCLUSIONS：DMY inhibits HG-induced MCs proliferation and improves diabetic nephropathy glomerulosclerosis by combining with Smad2 and inhibiting Smad2 phosphorylation to reduce the extracellular matrix protein FN expression.

Dihydromyricetin；Glomerular mesangial cells；Proliferation；Fibronectin；Molecular docking

R587.2

A

1001-0408（2017）34-4784-04

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.34.08

国家自然科学基金资助项目（No.31660334）；江西省青年科学基金资助项目（No.20161BAB215217）

＊副教授，硕士。研究方向：天然药物活性成分。电话：0797-8169775。E-mail：jialinli2005@126.com

#通信作者：副教授，博士。研究方向：糖尿病肾病发病机制及药物防治。电话：0797-8169770。E-mail：wusuzhen2005@126.com

2017-06-12

2017-09-17）

（编辑：林静）