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液态发酵对西农9940苦荞主要成分及其抗氧化活性的强化作用

2017-12-11汪雪娇孙旭春兰永丽李腾宇冯宪超李志西

食品科学 2017年24期
关键词:渣中苦荞芦丁

汪雪娇,孙旭春,兰永丽,李腾宇,师 帅,杨 霞,冯宪超,*,李志西,*

液态发酵对西农9940苦荞主要成分及其抗氧化活性的强化作用

汪雪娇1,孙旭春1,兰永丽1,李腾宇1,师 帅2,杨 霞3,冯宪超1,*,李志西1,*

(1.西北农林科技大学食品科学与工程学院,陕西 杨凌 712100;2.山西杏花村汾酒集团有限责任公司,山西 汾阳 032200;3.成都市青白江区市场和质量监督管理局,四川 成都 610300)

利用液态发酵技术富集苦荞渣中的营养物质,测定分析西农9940苦荞粉及其经液态发酵后所得苦荞渣的蛋白质、粗脂肪、矿物质、粗纤维、灰分、总黄酮、总酚含量以及氨基酸和脂肪酸组成,并以总还原能力、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-dipheny1-2-picryl-hydrazyl,DPPH)自由基和2,2’-联氮-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐自由基(2,2’-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate) radical,ABTS+·)清除能力为指标对抗氧化活性进行综合评价。结果表明苦荞渣的蛋白质、粗脂肪、灰分、粗纤维、矿物质含量均显著提高,且液态发酵过程不改变苦荞粉的氨基酸及脂肪酸组成。苦荞渣的总酚含量为1 343.22 mg/100 g,显著高于苦荞粉559.76 mg/100 g,总黄酮含量为2 186.06 mg/100 g,显著低于苦荞粉2 464.10 mg/100 g,芦丁和槲皮素含量的测定也进一步证明发酵后苦荞渣的总黄酮含量显著降低,但其总还原能力、DPPH自由基和ABTS+·清除能力显著高于苦荞粉,说明经过发酵后苦荞渣的抗氧化能力更强。

苦荞粉;发酵;多酚;黄酮;抗氧化活性

苦荞是一种重要的蓼科杂粮作物,主要种植在中国西南部,如云南、四川、贵州[1],种植面积约为2.5×105~3×105hm2,此外,在山西、陕西、重庆、宁夏、甘肃也有分布。苦荞富含多种营养成分,其蛋白质含量显著高于水稻、小麦、高粱、小米和玉米,且氨基酸种类丰富,其中赖氨酸含量高达64 mg/g,为大米的2.7 倍。苦荞富含多不饱和必需脂肪酸(亚油酸),矿物质(K、Mg),VB1、VC、VE和D-手性肌醇[2-3]。此外,研究发现,苦荞中含有大量黄酮类化合物,如芦丁、槲皮素等[4-6],具有降胆固醇、抗氧化和清除自由基活性,以及抑制脂肪堆积、抗高血压、抗炎、减少结肠癌发生等作用[7]。近年来,越来越多的人重新开始关注苦荞的利用[8]。其中,通过发酵技术生产富含功能性成分的苦荞酒是常用的手段之一。在发酵过程中,淀粉最终被利用产生酒精,一些生物活性物质,例如类黄酮等也随之溶于酒中,但是大部分的物质,例如蛋白质、粗纤维、大部分糖类、多酚类物质却富集于苦荞渣中,得不到充分的利用[9]。

中国是白酒的生产和消费大国,据统计,2013年中国白酒年产量达到1 200万 t,而每年产生的酒渣达到2 500万 t左右[10]。大量的废弃酒渣转化利用不足造成了资源的浪费。目前,酒渣的再利用途径主要包括生产有机肥、发酵饲料、食用菌、燃料棒、活性炭和食醋等[10-11]。本研究旨在利用液态发酵技术富集苦荞渣中的营养物质,为后续提取苦荞渣蛋白、多酚类等物质提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

西农9940由西北农林科技大学农学院提供,样品经除杂精选后,粉碎,过40 目筛,备用。

糖化酶(酶活力100 000 U/g) 湖南鸿鹰翔生物股份有限公司;液化酶(酶活力20 000 U/mL) 湖南省津市新型发酵责任有限公司;芦丁、槲皮素、没食子酸、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-dipheny1-2-picrylhydrazyl,DPPH)、2,2’-联氮-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(2,2’-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate),ABTS) 美国Sigma公司;甲醇、氯化钙、无水乙醚、浓硫酸、浓盐酸、硫酸钾、硫酸铜、茚三酮、苯酚、氢氧化钠、氢氧化钾、正辛醇、亚硫酸钠、氢氧化钠、氯化钾、冰醋酸、磷酸、磷酸二氢钾、无水乙醇、无水碳酸钠、抗坏血酸、K2S2O8均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

T-203电子天平 美国丹佛公司;FW100高速万能粉碎机 天津泰斯特仪器有限公司;202-00干燥箱 北京化玻联医疗器械有限公司;150A恒温培养箱 江苏常州华普达教学仪器有限公司;TD5A台式离心机 湖南凯达科学仪器有限公司;WYT-4手持糖度计 福建省泉州光学仪器厂;HH-S4数显恒温水浴锅 北京科伟永兴仪器有限公司;DS20凯氏定氮仪 瑞典FOSS公司;Solaar M6原子吸收分光光度计 美国热电公司;AFS-1201双道原子荧光分光光度计 北京海光公司;UV-1700紫外-可见分光光度计 日本京都岛津制作所;KH5200B超声波清洗器 昆山禾创超声仪器有限公司;LC-15C高效液相色谱仪 日本岛津公司。

1.3 方法

1.3.1 苦荞渣的制备

液化:苦荞粉和水按1∶7(kg/L)混合,加入原料量2‰的CaCl2,采用两段加酶法加入液化酶,液化阶段以液化醪与碘液反应不变蓝为终点;糖化:将液化醪降温至60 ℃,加入糖化酶,60~62 ℃条件下糖化4~6 h,用手持糖度计测定糖化醪糖度;酒精发酵:将活性干酵母(添加量为3‰,以苦荞粉干质量计)用2%的糖水活化,加入已降至35 ℃的糖化醪中,35 ℃发酵4 d;离心:将发酵所得的酒,用高速离心机3 900 r/min离心10 min,倒掉上清液,取出沉淀,即得苦荞渣;干燥:50 ℃条件下烘干苦荞渣24 h,粉碎后储存于4 ℃冰箱中,备用。

1.3.2 主要成分测定

参考国标法,测定苦荞粉及发酵后得到的苦荞渣的水分、蛋白质、粗脂肪、矿物质、粗纤维、灰分含量以及氨基酸组成、脂肪酸组成。

1.3.3 体外抗氧化提取液的制备

准确称取苦荞粉及苦荞渣样品各1 g,置于50 mL三角瓶中,各加入体积分数80%乙醇溶液20 mL混匀,75 ℃超声辅助提取20 min,3 800 r/min离心10 min,取出上清液,沉淀重复以上操作,取出并合并2 次得到的上清液,定容到50 mL容量瓶中,密封冷藏保存,备用[12]。

1.3.4 总黄酮含量测定

根据NaNO3-AlCl3法[13-14]稍作修改。以芦丁质量浓度X(mg/mL)为横坐标,于波长510 nm处测定吸光度Y为纵坐标绘制标准曲线,得到线性回归方程:Y=12.599X+0.045 9(R2=0.999 5)。根据标准曲线计算样品提取液的总黄酮含量,结果以每100 g干基样品中芦丁当量毫克数表示(mg/100 g)。

1.3.5 总酚含量测定

采用Folin-Ciocalteu法测定总酚含量[15],以没食子酸质量浓度C(mg/mL)为横坐标,于波长760 nm处测定吸光度Y为纵坐标绘制标准曲线,得到线性回归方程:Y=123.48X+0.130 4(R2=0.998 5)。根据标准曲线计算样品提取液的总酚含量,结果以每100 g干基样品中没食子酸当量毫克数表示(mg/100 g)。

1.3.6 总还原能力测定

参照范金波等[14]的铁氰化钾法。以VC质量浓度X(mg/mL)为横坐标,于波长700 nm处测定吸光度Y为纵坐标绘制标准曲线,得到线性回归方程:Y=0.092 1X+0.017 8(R2=0.998 0)。根据标准曲线计算样品提取液的总还原能力,以100 g干基样品中所含VC当量毫克数表示(mg/100 g)。

1.3.7 DPPH自由基清除能力测定

参照张小娜等[16]方法,稍作修改。以VC质量浓度X(mg/mL)为横坐标,DPPH自由基清除率Y(%)为纵坐标绘制标准曲线,得到线性回归方程:Y=6.576 6X-1.355 3(R2=0.997 9)。取100 μL稀释4 倍的样品提取液,按照制作标准曲线同样的步骤测定样品提取液的吸光度,计算样品提取液的DPPH自由基清除率,样品的自由基清除能力以100 g干基样品中所含VC当量毫克数表示(mg/100 g)。DPPH自由基清除率按公式(1)计算:

式中:A样品为样品提取液在波长517 nm处的吸光度;A空白为提取样品的溶剂80%乙醇溶液在波长517 nm处的吸光度。

1.3.8 ABTS+·清除能力测定

参照张小娜等[16]的方法,稍作修改。以VC质量浓度X(mg/mL)为横坐标,ABTS+·清除率Y为纵坐标绘制标准曲线,得到线性回归方程:Y=5.105 6X-1.657 8(R2=0.998 4)。取100 μL稀释一定倍数的样品提取液,按照制作标准曲线的步骤测定样品提取液的吸光度,计算样品提取液的ABTS+·清除率,样品的自由基清除能力以100 g干基样品中所含VC当量毫克数表示(mg/100 g)。ABTS+·清除率按公式(2)计算:

式中:A样品为样品提取液在波长734 nm处的吸光度;A空白为提取样品的溶剂80%乙醇溶液在波长734 nm处的吸光度。

1.3.9 高效液相色谱测定提取液中芦丁、槲皮素含量

采用高效液相色谱法作定量分析。色谱柱:Shim-Pack VP-ODS C18(150 nm×4.6 mm,5 µm);进样量10 μL,柱温25 ℃,流速1.0 mL/min;流动相为0.5%乙酸-甲醇溶液(35∶65,V/V),检测器波长361 nm;样品进样前经过0.5 μm微孔膜过滤,根据出峰时间和峰面积对样品中的芦丁、槲皮素进行定性、定量分析。

1.4 数据处理

采用SPSS 20.0软件和Excel 2010软件对实验数据进行处理。

2 结果与分析

2.1 苦荞粉及苦荞渣主要成分比较分析

表1 苦荞粉与苦荞渣中主要营养成分的测定结果Table 1 Main nutritional components of tartary buckwheat flour and tartary buckwheat residue

苦荞酒中蛋白质质量浓度为0.085 mg/mL,说明发酵后只有极少量的蛋白质等成分溶于酒中,而大部分富集在了苦荞渣中。因此,分别对苦荞粉及苦荞渣的水分、蛋白质、粗脂肪、矿物质、粗纤维和灰分进行测定,如表1所示。苦荞粉的水分质量分数为11.33%,而苦荞渣的水分质量分数为5.92%,本研究中其他成分的测定结果均以干质量计,水分含量不会对其造成影响。

苦荞粉蛋白质质量分数为10.97%,高于王敏等[17]的研究结果(苦荞蛋白质质量为9.34%)。发酵后苦荞渣的蛋白质质量分数为40.63%,显著高于苦荞粉(3.7 倍),原因是在液态发酵过程中苦荞粉中的淀粉被液化酶(α-淀粉酶)水解生成糊精,再经糖化酶(葡萄糖淀粉酶)糖化生成葡萄糖,进而被酵母利用产生酒精,从而对蛋白质等成分起到浓缩作用[18-19]。为了探究苦荞发酵前后氨基酸含量和组成的变化,利用氨基酸分析仪测定氨基酸含量变化。由表2可以看出,谷氨酸含量最高,其次是天冬氨酸和精氨酸,与郭晓娜[20]和张丽君[21]等测得的苦荞蛋白质中非必需氨基酸含量较高的是谷氨酸和天冬氨酸的结果相一致。发酵后苦荞渣中的氨基酸含量显著增加,并且发酵前后各氨基酸在总氨基酸中所占的百分比基本相同,说明液态发酵过程没有改变苦荞蛋白质的氨基酸组成和配比。苦荞蛋白质的18 种氨基酸组成更加均衡合理、配比适宜,特别是蛋氨酸、谷氨酸、组氨酸、赖氨酸、精氨酸和天冬氨酸含量较为丰富[14]。

表2 苦荞粉与苦荞渣中氨基酸的质量分数Table 2 Amino acid composition of tartary buckwheat flour and tartary buckwheat residue

表3 苦荞粉与苦荞渣中脂肪酸的质量分数Table 3 Fatty acid composition of tartary buckwheat flour and tartary buckwheat residue

由表1可知,西农9940苦荞粉粗脂肪质量分数为4.53%,其含量略高于Zhu Fan[8]报道的苦荞粗脂肪含量(2.8%),这可能和苦荞的遗传性、生育特性以及生长环境如地理位置和生长季节有关[22]。苦荞渣粗脂肪质量分数为12.65%,是苦荞粉脂肪含量的2.8 倍,同蛋白质一样,液态发酵过程对粗脂肪起到了富集作用。从表3可以看出,在苦荞发酵前后均能检测到5 种脂肪酸,其质量分数由高到低依次是亚油酸>油酸>棕榈酸>α-亚麻酸>硬脂酸,与郎桂常[23]的测定结果相一致。8 个样品脂肪酸中不饱和脂肪酸的含量丰富,其中亚油酸和油酸占总脂肪酸含量的85.5%,远高于小麦粉中两者的含量(64%左右)[17]。不饱和脂肪酸高度稳定,具有抗氧化作用。发酵前后样品中各脂肪酸占总脂肪酸百分比差异不大,说明发酵过程基本没有改变苦荞的脂肪酸组成。

表4 苦荞粉与苦荞渣中矿质元素的含量Table 4 Mineral element composition of tartary buckwheat flour and tartary buckwheat residuemg/kg

由表4可知,苦荞粉和苦荞渣中富含多种矿质营养元素。其中含量最多的常量元素为K,其次为Ca,最低的为Mg,苦荞粉和苦荞渣中K含量分别为3 740.92、5 321.19 mg/kg两者均远高于小麦粉中K含量1 950 mg/kg和玉米粉中K含量2 700 mg/kg[24]。含量最高的微量元素为Fe,其次为Zn,最低的为Mn,苦荞粉和苦荞渣中Fe含量分别为101.1、827.19 mg/kg,远高于禾谷类的小麦粉(42 mg/kg)、大米(24 mg/kg)和玉米(16 mg/kg),相对于其他主粮,苦荞中铁含量丰富,能充分保证人体制造血红素对铁元素的需要,这对于防止缺铁性贫血具有重要的作用。发酵后得到的苦荞渣中矿物质的总含量均显著大于苦荞粉中矿物质总含量,发酵过程使矿物元素在苦荞渣中富集,苦荞渣可添加于动物饲料中作为必需矿物元素的一个良好来源。

由表1可知,西农9940苦荞粉的灰分质量分数为2.50%,而苦荞渣的灰分质量分数为5.40%。苦荞渣的粗纤维质量分数为3.82%,高于小麦和玉米中粗纤维含量,是相应苦荞粉(1.40%)的2.7 倍。通过液态发酵,苦荞粉中的矿质元素、粗纤维富集在了苦荞渣中。食用荞麦纤维具有降血脂特别是降低血清总胆固醇及低密度脂蛋白胆固醇的功效,同时,在降低血糖和改善糖耐量等方面也具有很好的作用[19-21]。因此,苦荞渣可作为富含膳食纤维的食物来源。

2.2 抗氧化能力分析

由图1A可看出,西农9940苦荞粉中总黄酮含量为2 464.10 mg/100g,测定结果与Liu Benguo等[25]的研究中苦荞籽粒黄酮质量分数高达2.42%相接近。苦荞渣中总黄酮含量分别为2 186.06 mg/100 g,低于苦荞粉中总黄酮的含量。原因可能是发酵过程中,苦荞中的黄酮类物质如芦丁、山柰酚等少量溶于苦荞酒中造成了总黄酮含量的减少。表5进一步表明,发酵后得到的苦荞渣中芦丁含量远低于苦荞粉,而槲皮素含量大大增加,芦丁的减少与芦丁降解酶有关,苦荞籽粒中存在天然的高活性β-糖苷酶-芦丁降解酶是一种专一性酶,主要作用于芦丁对其他黄酮不起作用,在高水分活度条件下β-糖苷酶-芦丁降解酶激活迅速将芦丁分解为槲皮素和芸香糖,而在液化、糖化、发酵过程中都有大量的水参与,所以芦丁发生降解,槲皮素含量增加[26]。然而,苦荞粉的总还原能力、DPPH自由基清除能力和ABTS+·清除能力均小于苦荞渣,这是因为黄酮含量多少与芦丁含量呈一一对应关系,而芦丁的含量与抗氧化活性并不成正比[27]。槲皮素的抗氧化性强于芦丁,发酵后苦荞渣中槲皮素含量大大增加,所以苦荞渣的抗氧化能力强于苦荞粉[2]。

由图1B可以看出,西农9940苦荞粉中总酚含量为559.76 mg/100 g,而发酵后的苦荞渣中总酚含量为1 343.22 mg/100 g,无论是苦荞粉还是苦荞渣,总酚含量明显高于玉米、小麦、小米、大米等谷物总酚含量[28]。发酵后得到的苦荞渣中总酚含量显著大于发酵前苦荞粉,液态发酵过程使多酚类物质在苦荞渣中富集,苦荞渣富含植物多酚,是制备植物多酚的一个优良来源。

如图1C所示,西农9940苦荞粉的总还原能力为1 854.65 mg/100 g,发酵后得到的苦荞渣总还原能力为2 576.83 mg/100 g,显著高于苦荞粉的总还原能力。一种化合物具备抗氧化能力的最明显体现是该化合物的还原能力[29],由实验结果可以看出,苦荞渣还原能力强于苦荞粉,因此苦荞渣具有更强的抗氧化能力。

由图1D可以看出,西农9940苦荞粉的DPPH自由基的清除能力为2 115.05 mg/100 g,显著低于发酵后苦荞渣的DPPH自由基清除能力(2 782.70 mg/100 g)。说明它们降低羟自由基、烷自由基或过氧自由基有效浓度、打断脂质过氧化链反应的作用更大[30]。

由图1E可以看出,发酵前西农9940苦荞粉的ABTS+·清除能力为1 667.28 mg/100 g,显著低于发酵后得到的苦荞渣对ABTS+·的清除能力(2 823.60±99.18) mg/100 g。苦荞渣对ABTS+·的清除能力为苦荞粉的1.7 倍,说明苦荞渣具有更强的体外抗氧化能力。

图1 苦荞粉与苦荞渣抗氧化能力比较分析Fig. 1 Comparative analysis of antioxidant capacity of tartary buckwheat flour and tartary buckwheat residue

表5 高效液相色谱测定苦荞粉和苦荞渣中芦丁、槲皮素含量Table 5 Rutin and quercetin contents of tartary buckwheat flour and tartary buckwheat residue mg/100 g

3 结 论

本研究利用苦荞粉经糖化、液化、酒精发酵、离心、干燥得到苦荞渣,在整个液态发酵过程中,酵母只利用了淀粉液化所得的葡萄糖,其他成分如蛋白质、粗脂肪、矿物质、粗纤维、酚类物质并没得到充分的利用,而是富集在了苦荞渣中,所以苦荞渣起到了浓缩营养物质的作用。相对于发酵前的苦荞粉,发酵后得到的苦荞渣中蛋白质、粗脂肪、矿物质(如K、Ca、Fe、Cu)、粗纤维含量均显著增加,且脂肪酸组成和氨基酸组成未发生变化。结果显示,发酵后苦荞渣中的总酚含量显著增加,且总还原能力、DPPH自由基和ABTS+·清除能力均高于苦荞粉,说明苦荞渣的抗氧化能力更强,而总黄酮含量显著降低,高效液相色谱结果也显示发酵后芦丁减少、槲皮素增加,但总黄酮含量依然低于发酵前苦荞粉黄酮含量。

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[30] 冯歆轶. 杂粮醋功能特性比较研究[D]. 杨陵∶ 西北农林科技大学, 2009.

Liquid-State Fermentation Increases the Main Components and Antioxidant Activity of Xinong 9940 Tartary Buckwheat

WANG Xuejiao1, SUN Xuchun1, LAN Yongli1, LI Tengyu1, SHI Shuai2, YANG Xia3, FENG Xianchao1,*, LI Zhixi1,*
(1. College of Food Science and Engineering, Northwest A&F University, Yangling 712100, China;2. Shanxi Xinghuacun Fenjiu Group Co. Ltd., Fenyang 032200, China;3. Organization Department of CPC Chengdu Qingbaijiang District Committee, Chengdu 610300, China)

In order to enrich nutrients in tartary buckwheat residue by liquid-state fermentation, the contents of protein, crude fat, minerals, crude fiber, ash, total flavonoids, total phenolics, amino acid composition and fatty acid composition in Xinong 9940 tartary buckwheat flour and its residue left after being subjected to liquid-state fermentation were analyzed and the antioxidant activity was evaluated by total reducing capacity, 1,1-dipheny1-2-picryl-hydrazyl (DPPH) radical scavenging,2,2’-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate) (ABTS) radical scavenging assays. The results showed that protein,crude fat, ash, crude fiber, minerals contents of buckwheat residue increased significantly after fermentation. Furthermore,liquid-state fermentation did not change the amino acid and fatty acid composition of buckwheat flour. The total phenolic content of tartary buckwheat residue was 1 343.22 mg/100 g, which was significantly higher than that of buckwheat flour(559.76 mg/100 g), and the total flavonoids content was 2 186.06 mg/100 g, which was significantly lower than that of buckwheat flour (2 464.10 mg/100 g). Moreover, the contents of the flavonoids rutin and quercetin significantly decreased after fermentation. However, the total reducing capacity, DPPH radical scavenging capacity, and ABTS+· scavenging ability were significantly higher than those of tartary buckwheat flour. These results indicated that tartary buckwheat residue showed stronger antioxidant after fermentation.

tartary buckwheat flour; fermentation; polyphenols; flavonoids; antioxidant activity

2016-11-12

国家自然科学基金面上项目(31771991);国家自然科学基金青年科学基金项目(31601497);

2016年度第59批中国博士后科学基金面上项目(2016M591857);

国家肉品质量安全控制工程技术研究中心开放基金项目(M2015K06;M2016K01);

中央高校基本科研业务费专项(2452015062)

汪雪娇(1990—),女,硕士,研究方向为粮食工程与发酵技术创新。E-mail:wangxuejiao173@163.com

*通信作者:冯宪超(1981—),男,副教授,博士,研究方向为食品蛋白质结构与功能。E-mail:fengxianchao1@hotmail.com

李志西(1958—),男,教授,博士,研究方向为粮食工程与发酵技术创新。E-mail:lizhixi@nwsuaf.edu.cn

DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201724011

TS201.2

A

1002-6630(2017)24-0068-06

汪雪娇, 孙旭春, 兰永丽, 等. 液态发酵对西农9940苦荞主要成分及其抗氧化活性的强化作用[J]. 食品科学, 2017,38(24)∶ 68-73. DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201724011. http∶//www.spkx.net.cn

WANG Xuejiao, SUN Xuchun, LAN Yongli, et al. Liquid-state fermentation increases the main components and antioxidant activity of Xinong 9940 tartary buckwheat[J]. Food Science, 2017, 38(24)∶ 68-73. (in Chinese with English abstract)DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201724011. http∶//www.spkx.net.cn

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