PARP-1、Caspase-3在子宫内膜癌组织中的表达变化及意义

宫莹莹，何玉，席玉玲

(蚌埠医学院第一附属医院，安徽蚌埠233004)

PARP-1、Caspase-3在子宫内膜癌组织中的表达变化及意义

宫莹莹，何玉，席玉玲

(蚌埠医学院第一附属医院，安徽蚌埠233004)

目的探讨多聚ADP核糖聚合酶1(PARP-1)、半胱氨酸蛋白酶3(Caspase-3)在子宫内膜癌组织中的表达变化及其临床意义。方法收集子宫内膜癌组织60例份、正常子宫内膜组织20例份、子宫内膜增生组织20例份，采用免疫组化法检测各组织PARP-1、Caspase-3蛋白表达，分析子宫内膜癌组织PARP-1、Caspase-3表达与患者临床病理参数的关系及二者的相关性。结果子宫内膜癌组织、正常子宫内膜组织及子宫内膜增生组织PARP-1阳性表达率分别为73.33%、15.00%、45.00%，不同组织间PARP-1阳性表达率比较P<0.05或<0.01。子宫内膜癌组织、正常子宫内膜组织及子宫内膜增生组织Caspase-3阳性表达率分别为41.67%、85.00%、45.00%，正常子宫内膜组织Caspase-3阳性表达率高于子宫内膜癌组织及子宫内膜增生组织(P均<0.01)。子宫内膜癌组织PARP-1阳性表达与患者的临床分期、分化程度、浸润深度均有关(P均<0.05)，与淋巴结转移无关(P>0.05)。子宫内膜癌组织Caspase-3阳性表达与患者的临床分期、分化程度、浸润深度及淋巴结转移均无关(P均>0.05)。子宫内膜癌组织PARR-1、Caspase-3阳性表达率呈负相关(r=-0.64，P<0.01)。结论子宫内膜癌组织PARP-1表达升高、Caspase-3表达降低；PARP-1表达升高可能参与子宫内膜癌的发生与发展。

子宫内膜癌；多聚ADP核糖聚合酶1；半胱氨酸蛋白酶3

子宫内膜癌占女性生殖系统恶性肿瘤的20%～30%，其具体发病机制尚未研究清楚[1]。多聚ADP核糖聚合酶1( PARP-1)是一种具有多功能的蛋白质翻译后修饰功能的核酶，在DNA突变修复尤其是DNA单链断裂修复，以及维持基因组稳定性中具有至关重要的作用[3]。研究表明，PARP-1在多种恶性肿瘤组织中表达异常[4～8]，其与肿瘤发生的关系也逐渐成为研究热点。半胱氨酸蛋白酶3(Caspase-3)是引起细胞凋亡的关键酶，在细胞凋亡级联反应通路中起核心作用。激活Caspase-3可降解多种酶底物，使级联反应效应增强，从而使细胞完成凋亡的全过程。PARP-1作为Caspase最重要的酶底物，参与其介导的细胞凋亡，两者的协同作用在凋亡机制中具有重要作用，但两者在子宫内膜癌组织中的表达变化及其临床意义鲜见报道。为此我们进行了如下研究。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2010～2013年于蚌埠医学院第一附属医院行手术治疗的子宫内膜癌患者60例，术中收集其子宫内膜癌组织标本。患者均经术后病理证实，术前均未经放疗、化疗或免疫治疗。年龄35～68岁，平均52岁；临床分期参照2009年FIGO手术病理分期标准：Ⅰ期37例，Ⅱ期19例，Ⅲ期4例；分化程度按FIGO组织分化标准：高分化22例，中分化32例，低分化6例；浸润深度：<1/2肌层21例，≥1/2肌层39例；淋巴结转移：存在淋巴结转移4例，无淋巴结转移56例。选取同期经手术治疗的子宫内膜增生患者20例，年龄36～55岁，平均45岁，术中取其正常子宫内膜组织及子宫内膜增生组织各20例份。本研究通过医院伦理委员会审核，患者均知情同意。

1.2 组织PARP-1、Caspase-3检测 采用免疫组化法。将子宫内膜癌组织、正常子宫内膜组织及子宫内膜增生组织标本采用10%中性甲醛固定，石蜡包埋，4 μm厚度连续切片。采用免疫组化法检测组织PAPR-1、Caspase-3表达，操作步骤严格按试剂盒说明书进行。兔抗人PARP-1多克隆抗体工作浓度为1∶50，鼠抗人Caspase-3单克隆抗体工作浓度为1∶200， DAB显色，苏木素复染。采用IgG代替一抗作为阴性对照，用已知相应蛋白阳性切片作为阳性对照。PARP-1阳性染色为棕黄色或棕褐色颗粒，主要定位于细胞核；Caspase-3阳性染色为棕黄色颗粒，主要定位于细胞质，亦可见于细胞核和细胞核膜。所有切片由我院两位有经验的病理科医生采用双盲法进行观察，在高倍镜(×400)下随机选取10个阳性细胞较多的视野观察染色强度及阳性细胞百分比，每个视野计数100个细胞。染色强度评分：无着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。阳性细胞百分比评分：无阳性细胞为0分，阳性细胞数≤10%为1分，11%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分。染色强度及阳性细胞百分比评分相乘≥3为阳性表达，<3为阴性表达。

1.3 子宫内膜癌组织PARP-1、Caspase-3表达与患者临床病理参数的关系 收集子宫内膜癌患者的临床病理参数，包括临床分期、分化程度、浸润深度及淋巴结转移情况，分析子宫内膜癌组织PARP-1、Caspase-3表达与患者临床病理参数的关系。

1.4 统计学方法 采用SPSS20.0统计软件。计数资料以率表示，结果比较采用χ2检验。PARP-1与Caspase-3的关系采用Spearman相关分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 子宫内膜癌组织、正常子宫内膜组织及子宫内膜增生组织PARP-1、Caspase-3表达比较 子宫内膜癌组织、正常子宫内膜组织及子宫内膜增生组织PARP-1阳性表达率分别为73.33%(44/60)、15.00%(3/20)、45.00%(9/20)，不同组织间PARP-1阳性表达率比较P<0.05或<0.01。子宫内膜癌组织、正常子宫内膜组织及子宫内膜增生组织Caspase-3阳性表达率分别为41.67%(25/60)、85.00%(17/20)、45.00%(9/20)，正常子宫内膜组织Caspase-3阳性表达率高于子宫内膜癌组织及子宫内膜增生组织(P均<0.01)。

2.2 子宫内膜癌组织PARP-1、Caspase-3表达与患者临床病理参数的关系 子宫内膜癌组织PARP-1阳性表达与患者的临床分期、分化程度、浸润深度均有关(P均<0.05)，与淋巴结转移无关(P>0.05)。子宫内膜癌组织Caspase-3阳性表达与患者的临床分期、分化程度、浸润深度及淋巴结转移均无关(P均>0.05)。见表1。

2.3 子宫内膜癌组织PARP-1、Caspase-3表达的关系 子宫内膜癌组织PARR-1、Caspase-3阳性表达率呈负相关(r=-0.64，P<0.01)。

3 讨论

PARP是在真核细胞中催化聚二磷酸腺苷核酸糖化产生的一种蛋白翻译后修饰酶，参与DNA修复和转录、维持染色体结构、细胞凋亡等重要的生物学过程。PARP-1作为PARP家族中最重要的成员，是其中发挥主要作用的亚基。Barnett等[10]研究显示，晚期浆液性卵巢癌细胞PARP-1表达明显升高，且肿瘤细胞分化程度越低， PARP-1表达越高。分析原因：①肿瘤细胞增殖活跃，产生大量过氧化物如NO、氧自由基等，造成DNA损伤， DNA双链出现缺口或断裂，使得PARP-1立即活化，DNA损伤越重，产生的DNA断端越多， PARP-1表达越高[11]；②DNA断端增多甚至出现不规则DNA断裂，故在细胞修复过程中出现的错配修复比例也明显增高，PARP-1表达也随之升高；③ 过量DNA损伤在引起PARP-1活化的同时，降低了其对DNA 的修复活性，故分化程度越低的细胞PARP-1表达越高。本研究结果显示，子宫内膜癌组织、正常子宫内膜组织及子宫内膜增生组织PARP-1阳性表达率依次降低，子宫内膜癌组织PARP-1阳性表达率与患者的临床分期、分化程度、浸润深度均有关；说明子宫内膜癌组织PARP-1表达升高，并参与了子宫内膜癌的发生与发展。

表1 子宫内膜癌组织PARP-1、Caspase-3表达与患者临床病理参数的关系

细胞凋亡对于促进生物体进化、保证器官组织正常发育、维持生物体内环境稳定及免疫系统的正常功能均具有重要作用，细胞凋亡途径可分为Caspase依赖途径和非Caspase依赖途径，其中以前者更为重要[9]。细胞凋亡可以有效预防肿瘤发生，对肿瘤细胞具有负调控作用。正常子宫内膜细胞若出现凋亡通路紊乱、促凋亡因子表达抑制、凋亡抑制因子过度表达及凋亡基因表达失控等，均可导致细胞增殖与凋亡失衡，引起肿瘤的发生。Caspase-3作为Caspase家族的重要成员之一，实质为含有半胱氨酸的蛋白酶，以无活性的酶原形式存在于多个人体器官正常组织细胞中，位于细胞凋亡信号传导主要通路的核心位置。当Caspase-3酶原被多种凋亡刺激因子启动不同的蛋白酶切割时，Caspase-3即被激活，活化的Caspase-3可水解相应底物，并通过蛋白酶级联反应放大诱发凋亡。凋亡的途径大致分为：①线粒体/细胞色素c介导的细胞凋亡通路；②Fas死亡受体介导的凋亡通路。无论哪一种凋亡途径最终过程都是通过激活Caspase-3完成的，其为细胞凋亡中的关键蛋白酶，被称为死亡蛋白酶[12]。Zanotti等[13]报道，Caspase-3在正常宫颈上皮细胞、上皮内瘤变细胞、浸润癌细胞中的表达依次降低，提示Caspase-3表达降低可能参与宫颈上皮细胞的恶变过程。于红丽等[14]报道，Caspase-3在卵巢癌组织中的阳性率仅为0.5%，而在良性卵巢肿瘤及交界性卵巢上皮性肿瘤的阳性表达率均为100%，提示Caspase-3激活可能抑制肿瘤细胞增殖，避免卵巢癌的发生。本研究结果显示，子宫内膜癌组织及子宫内膜增生组织Caspase-3阳性表达率均低于正常子宫内膜组织；推测肿瘤细胞中Caspase-3表达降低，其活性缺失可能使肿瘤细胞在形成过程中逃避机体细胞凋亡的自我调节而不断增殖，细胞凋亡与增殖之间的动态平衡失调，最终导致子宫内膜癌的发生。本研究结果显示，子宫内膜癌组织Caspase-3阳性表达率与患者的临床分期、分化程度、浸润深度及淋巴结转移均无关；说明Caspase-3可能仅参与了子宫内膜癌细胞的凋亡失衡，并没有参与组织间质破坏和肿瘤细胞的黏附侵袭，与既往文献报道一致[15]。

当细胞出现损伤时，PARP-1被活化后识别损伤位点，催化尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)裂解为尼克酰胺和ADP核糖，进而合成为长链聚腺苷二磷酸核糖(PAR)，与PARP-1自身、p53、DNA连接酶、组蛋白等多种核受体蛋白共价结合，使其发生聚ADP核糖化而增加其活性。此后，PARP-1从DNA上释放，使DNA修复酶结合到DNA断裂处进行DNA修复。但当DNA损伤严重时， PARP-1被过度活化，其“细胞保护”功能即发生改变，为防止核蛋白过度聚二磷酸腺苷核糖化，导致NAD+和ATP大量消耗，此时将激活Caspase-3，PARP-1就成为Caspase-3 的“死亡底物”而被裂解，保证细胞凋亡的正常进行。本研究结果显示，子宫内膜癌组织PARR-1、Caspase-3阳性表达率呈负相关。理论上子宫内膜癌组织由于细胞损伤严重，PARP-1被大量激活，为避免肿瘤细胞过度增殖，Caspase-3也应被激活；但事实上子宫内膜癌细胞Caspase-3表达降低，阻断了肿瘤细胞的凋亡过程，使肿瘤细胞数目增加。因此，子宫内膜癌组织PARR-1、Caspase-3表达呈负相关。PARP-1过度表达引起Caspase-3表达降低的具体机制仍需进一步探究。

综上所述，子宫内膜癌组织PARP-1表达升高、Caspase-3表达降低；PARP-1表达升高可能参与了子宫内膜癌的发生与发展。

[1] American Cancer Society. Detailed guide: endometrial cancer: what are the risk factors for endometrial cancer Atlanta[M]. Ga American Cancer Society, 2005:102.

[2] 曹泽毅.中华妇产科学[M].2版.北京:人民卫生出版社,2004:2539.

[3] Takata T, Tanaka F, Yamada T, et al. Clinicalsignificance of caspase-3 expression in pathologic-stage I, nonsmall-cell lung cancer[J]. Int J Cancer, 2001,96 Suppl:54-60.

[4] Barton VN, Donson AM, Kleinschmidt-DeMasters BK, et al. PARP1 expression in pediatric central nervous system tumors[J]. Pediatr Blood Cancer, 2009,53(7):1227-1230.

[5] Nguewa PA, Fuertes MA, Cepeda V, et al. Poly (ADP-ribose) polymerase-1 inhibitor 3-aminobenzamide enhances apoptosis induction by platinum complexes in cisplatin-resistant tumor cells[J]. J Med Chem, 2006,2(1):47-53.

[6] Nosho K, Yamamoto H, Mikami M, et al. Over expression of poly (ADP-ribose) polymerase-1(PARP-1) in the early stage of colorectal carcinogenesis[J]. Eur J Cancer, 2006,42(14):2374-2381.

[7] Tentori L, Leonetti C, Scarsella M, et al. Inhibition of poly (ADP-ribose) polymerase prevents irinotecan-induced intestinal damage and enhances irinotecan/temozolomideefficacy against colon carcinoma[J]. FASEB J, 2006,20(10):1709-1711.

[8] Csete B, Lengyel Z, Kádár Z, et al. Poly(adenosine diphosphate-ribose) polymerase-1 expression in cutaneous malignant melanomas as a new molecular marker of aggressive tumor[J]. Pathol Oncol Res, 2009,15(1):47-53.

[9] 杨绍杰,孟金萍,屈祎,等.细胞凋亡信号转导通路的研究进展[J].中国比较医学杂志,2007,17(5):297-301．

[10] Barnett JC, Bean SM, Nakayamn JM, et al. High poly(adenosine diphosphate-ribose) polymerase expression and poor survival in sdvanced-stage serous ovatian cancer[J]. Obstet Gynecol, 2010,115(1):49-54.

[11] Zhao M, Gao FH. JAK2/STAT3 signaling pathway activation mediates tumor angiogenesis by upregu-lation of VEGF and bFGF in non-small-cell lung cancer[J]. Lung Cancer, 2011,73(3):366-374.

[12] 王淑荣,申存周.ATP、PARP、Caspase-3与细胞凋亡和胀亡[J].中国微循环,2009,13(6):638-640.

[13] Zanotti S, Fissefier-Eckhoff A. Changes in the topological expression of markers if differentiation and apoptosis in defined stages of human cervical dysplasia and carcinoma[J]. Gynecol Oncol, 2003,89(3):376-384．

[14] 于红丽,郑建华,赵宏敏.Survivin、caspase-3及PCNA在卵巢上皮性肿瘤中水平的临床意义[J].中国实用妇科与产科杂志,2007,23(12):948-950.

[15] SongY, Shen K, Xu F. Synergism of antitumor effects on ovarian carcinoma using autocatalytic caspase-3 combined with flavopiridol[J].中华妇产科杂志,2010,45(10):781-786.

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.44.030

R737.33

B

1002-266X(2017)44-0092-03

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