LC-MS/MS法在不明原因复发性流产患者血清10种氨基酸水平检测中的应用

许红，韩彦洁，张瑶，刘力

(石家庄市第四医院 石家庄市妇产医院，石家庄050000)

LC-MS/MS法在不明原因复发性流产患者血清10种氨基酸水平检测中的应用

许红，韩彦洁，张瑶，刘力

(石家庄市第四医院 石家庄市妇产医院，石家庄050000)

目的采用高效液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)法检测不明原因复发性流产(URSA)患者血清10种氨基酸水平变化，并对该方法进行评价。方法选择URSA患者40例作为观察组，同期孕检正常的早孕(孕周<20周)妇女40例作为对照组。采用LC-MS/MS法检测两组血清鸟氨酸、瓜氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、精氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸水平，并进行LC-MS/MS法检测的专属性、精密度及添加回收率、稳定性分析。结果观察组与对照组血清鸟氨酸分别为(89.3±8.9)、(33.6±5.4)μmol/L，瓜氨酸分别为(18.6±3.2)、(14.3±2.4)μmol/L，甘氨酸分别为(230.2±27.3)、(202.2±19.9)μmol/L，两组比较P均<0.01。两组血清丙氨酸、缬氨酸、精氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸水平比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。专属性分析结果显示，观察组血清中出现相应氨基酸的质荷比信号图，空白甲醇溶液中只有添加内标的质荷比信号，未见相应的氨基酸信号。精密度及添加回收率分析结果显示，采用LC-MS/MS法检测血清10种氨基酸水平的添加回收率为82.1%～93.6%，日内标准偏差为1.5%～5.1%，日间标准偏差为2.5%～7.1%。稳定性分析结果显示，样本放置2～7天的平均回收率为95.3%～103.2%。结论URSA患者血清鸟氨酸、瓜氨酸、甘氨酸水平均升高，血清丙氨酸、缬氨酸、精氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸水平无明显变化；LC-MS/MS法检测血清氨基酸的回收率、重复性和稳定性均较高。

复发性自然流产；高效液相色谱串联质谱法；氨基酸

复发性自然流产(RSA)是指与同一性伴侣连续发生≥2次于20孕周前妊娠物或胎儿丢失(胎儿体质量<500 g)[1]，在育龄妇女中发生率为0.4%～1.0%[2]。目前已知导致RSA的病因包括夫妻双方染色体异常及女性孕期内分泌功能异常、自身免疫性疾病、病原微生物感染、子宫解剖结构异常、环境异常因素等[3]。除上述因素外，仍有约50%的RSA患者尚未发现明确的致病因素，为不明原因复发性流产(URSA)[4,5]。孕妇体内氨基酸为胎儿蛋白的合成提供物质基础，与胎儿生长发育密切相关[6]。文献报道，孕妇氨基酸代谢紊乱是RSA发生的一个重要因素，如孕妇血浆同型半胱氨酸水平增高可明显增加RSA发生率[7]。受实验技术条件的影响，关于URSA患者血清氨基酸水平变化的相关研究报道较少[8]。2016年8月～2017年3月，本研究采用高效液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)法检测URSA患者血清10种氨基酸水平变化，并评价该方法的专属性、精密度及添加回收率、稳定性分析，旨在为URSA的病因学研究及其诊断、治疗提供理论依据。

1 临床资料

选择同期石家庄市妇产医院收治的URSA患者40例作为观察组，年龄20～35岁。纳入标准：①通过详细病史、常规血液学检查(血常规、血生化、抗磷脂抗体系列、血同型半胱氨酸等)及神经系统检查等未查明流产原因；②确诊妊娠后不明原因流产2次及以上，流产时孕周<20周，且既往有不明原因流产史；③入组前未接受任何药物治疗。排除标准：①生殖器官解剖异常；②合并内分泌、免疫、遗传疾病；③生殖泌尿系统急性感染；④身体其他部位存在明显感染。选择同期孕检正常的早孕妇女40例作为对照组，年龄20～35岁，孕周<20周，无自然流产、死胎、死产史。排除合并肝、肾等系统性疾病者、合并免疫性疾病者，宫内感染及存在其他临床发热征象者。两组年龄、孕周均具有可比性。本研究通过石家庄市妇产医院伦理委员会审核，受试者及其家属均知情同意。

2 方法与结果

2.1 血清10种氨基酸水平检测 采用LC-MS/MS法。两组入组次日空腹8 h后采血2 mL，立即以离心半径10.5 cm、转速3 500 r/min的离心机离心15 min，分离血清，将离心后的血清滴于903#专用采血滤纸上(直径>8 mm)，晾干后分批待测。用打孔器打孔(3 mm)采血滤纸，收集圆孔于96孔U型板中，每孔加入工作液90 μL，并覆上粘性封膜减少挥发。30 ℃条件下650 CPM振频振荡孵育45 min，转移70 μL上清液至V型底耐热微孔板中，覆上铝箔封膜减少挥发。将微孔板放入LC-MS/MS自动进样器中进行检测。

工作液配制：取同位素标准品50 μL，加入甲醇9.95 mL(稀释200倍)，密封4 ℃保存，使用时恢复至室温。色谱与质谱条件：流动相：100%甲醇溶液，进样量：20 μL，采用多反应监测(MRM)模式进行正离子扫描。离子喷射电压 5 000 V，温度 550 ℃；源内气体1(GS1，N2)压力350 kPa，气体2(GS2，N2)压力400 kPa，气帘气体(N2)压力135 kPa；碰撞气(N2)压力中等，解簇电压(DP)35 V，碰撞能量(CE)30 eV。

定量及数据处理：处理后的样本在LC-MS/MS平台检测得到总离子流，提取10 种氨基酸和对应内标的MRM离子流，进行积分处理。每20 μL进样中含有25 pmol从日常工作液中带入的丙氨酸、缬氨酸、鸟氨酸、精氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、瓜氨酸同位素内标，以及125 pmol甘氨酸同位素内标，以特定的校正系数K进行校准。校准公式：C1=A1×CIS×K/AIS。其中，C1为测试样本氨基酸浓度，A1为测试样本氨基酸峰面积，CIS为内标氨基酸浓度，K为特定校准系数，AIS为内标氨基酸峰面积。定量方法参考既往文献[9]。

2.2 LC-MS/MS法检测血清氨基酸的方法学评价

2.2.1 专属性分析 在1.2色谱质谱条件下检测空白甲醇溶液与URSA患者血清不同质荷比的氨基酸信号强度，验证方法专属性。结果显示，观察组血

表1 两组血清10种氨基酸水平比较

注：与对照组比较，*P<0.01。

清中出现相应氨基酸的质荷比信号图，空白甲醇溶液中只有添加内标的质荷比信号，未见相应氨基酸的信号。

2.2.2 精密度及添加回收率分析 将含各氨基酸的血液样本进行添加回收实验和精密度实验，参照1.2的方法进行预处理及检测，丙氨酸、缬氨酸、鸟氨酸、亮氨酸、甘氨酸的添加浓度均为10、50、100 μmol/L，精氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸的添加浓度均为10、20、50 μmol/L，蛋氨酸、瓜氨酸的添加浓度均为5、10、20 μmol/L。每日平行测定添加样本5次，计算其添加回收率和日内相对标准偏差，连续测定5天，计算其日间相对标准偏差。结果显示，采用LC-MS/MS法检测血清10种氨基酸水平的添加回收率为82.1%～93.6%，日内标准偏差为1.5%～5.1%，日间标准偏差为2.5%～7.1%。见表2。

2.2.3 稳定性分析 将离心后高、低浓度的质控血滴于采血滤纸上，同一样本分别放置1～7天，每天检测3次，以第1天检测为基准。结果显示，样本放置2～7天的平均回收率为95.3%～103.2%。见表3。

3 讨论

URSA的发病机制复杂，迄今尚未明确，无法采取针对性治疗，是困扰生殖医学和妇产科学的一大难题[10,11]。近年来文献报道，氨基酸为胎儿蛋白质合成提供物质基础，与胎儿生长发育密切相关，蛋白质和氨基酸代谢可能与URSA发病机制有关[12]。首先，母体或胎盘氨基酸转运障碍，输送至胎儿生长微环境的氨基酸量不足，可导致胎儿发育不良而流产；其次，母体分解代谢亢进，母体-胎盘-胎儿循环链代谢失衡亦可导致胎儿停育。本研究采用LC-MS/MS法检测URSA患者血清10种氨基酸水平，旨在为URSA的病因学研究及其诊断、治疗提供理论依据，同时有助于筛查URSA患者血清生物标记物。

缬氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸为人体必需氨基酸，对胎儿在宫内发育具有重要影响[13]，丙氨酸、鸟氨酸、精氨酸、酪氨酸、蛋氨酸与胎儿宫内生长迟缓及胎儿早产有关[14]，甘氨酸和瓜氨酸作为抑制性氨基酸与胎儿畸形及出生缺陷有关[15]。鸟氨酸在体内与胺甲酰磷酸化合生成瓜氨酸和磷酸，瓜氨酸再转化为精氨酸，精氨酸再裂解为尿素和鸟氨酸，这一代谢途径在代谢上具有重要作用[16]。精氨酸降低可导致胎儿生长受限，可能会影响正常妊娠导致早产[17]。甘氨酸不仅是中枢神经系统的抑制性神经递质，而且还广泛参与代谢调控、抗氧化和凋亡、 调节血脂代谢等病理生理学过程[18]。本研究结果显示，观察组血清鸟氨酸、瓜氨酸、甘氨酸水平均高于对照组，两组血清丙氨酸、缬氨酸、精氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸水平比较差异均无统计学意义；说明血清鸟氨酸、瓜氨酸、甘氨酸水平变化可能参与了URSA的发生，未来可针对上述3种氨基酸深入研究URSA的发生机制。本研究专属性分析结果显示，观察组血清中出现相应氨基酸的质荷比信号图，空白甲醇溶液中只有添加内标的质荷比信号，未见相应氨基酸的信号，说明本方法具有良好的专属性和特异性；精密度及添加回收率分析结果显示，采用LC-MS/MS法检测血清10种氨基酸水平的添加回收率为82.1%～93.6%，日内标准偏差为1.5%～5.1%，日间标准偏差为2.5%～7.1%，说明该方法具有良好的添加回收率和精密度；稳定性分析结果显示，样本放置2～7天的平均回收率为95.3%～103.2%，说明该样本在室温下放置7天对检测结果无明显影响。以上均说明采用LC-MS/MS法检测血清氨基酸的回收率、重复性和稳定性均较高，操作简单、快速。

表2 血液氨基酸精密度及添加回收率测定结果

表3 血液氨基酸稳定性测定结果

本研究为了提升检测效果，对几个重要的检测条件进行了优化。由于氨基酸分子量均较小，检测中选用较小的离子喷射电压，经过优化调试发现离子喷射电压在5 000 V时信号较高且稳定。离子化温度低于500 ℃时会导致离子化程度不充分，影响氨基酸检测响应值和定量结果；而当离子化温度高于650 ℃时又会造成离子化过程中部分中性基质碳化或焦化，污染离子源，降至550 ℃后离子化效果较好且不易焦化。由于气帘气过小容易污染标本，使中性分子和污染物进入质谱，造成基线过高而影响准确性，因此本研究气帘气选择为135 kPa。

综上所述，URSA患者血清鸟氨酸、瓜氨酸、甘氨酸水平升高，丙氨酸、缬氨酸、精氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸水平无明显变化。人体中氨基酸种类众多，本研究仅涉及其中10种相关氨基酸，后续将继续对URSA患者体内其他相关氨基酸水平变化进行深入研究，为明确URSA的发病机制提供依据。

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ApplicationofLC-MS/MSmethodindetectionof10kindsofaminoacidsinserumofpatientswithunexplainedrecurrentspontaneousabortion

XUHong,HANYanjie,ZHANGYao,LIULi

(TheFourthHospitalofShijiazhuang,Shijiazhuang050000,China)

ObjectiveTo detect the changes of 10 kinds of amino acid levels in patients with unexplained recurrent spontaneous abortion (URSA) by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) method, then to evaluate the performance of this method.MethodsForty URSA patients were used as the observation group, 40 normal early pregnancy women (<20 weeks) were arranged as the control group. LC-MS/MS method was used to detect ornithine, citrulline, glycine, alanine, valine, arginine, leucine, methionine, phenylalanine, and tyrosine levels in the two groups. The specificity, precision, recovery rate, and stability of LC-MS/MS method were also analyzed.ResultsThe serum ornithine levels in the observation group and control group were (89.3±8.9) and (33.6±5.4) μmol/L, respectively; citrulline levels were separately (18.6±3.2) and (14.3±2.4) μmol/L, and glycine levels were separately (230.2±27.3) and (202.2±19.9) μmol/L(allP<0.01). No significant difference was found in the levels of serum alanine, valine, arginine, leucine, methionine, phenylalanine, and tyrosine between the two groups (allP>0.05). The specificity analysis showed that the amino acid m/z was observed in the serum of the observation group, and there was only internal standard m/z in methanol blank solution, no m/z of the corresponding amino acid. The precision and recovery rate analysis showed that the recovery rate of the method was 82.1%-93.6%, the within-day relative standard deviation (RSD) was 1.5%-5.1% and the between-days RSD was 2.5%-7.1%. The stability analysis showed that the average recovery rate was 95.3%-103.2% for 2-7 days.ConclusionsThe levels of serum ornithine, citrulline, and glycine increase in URSA patients, but no significant changes are found in the serum alanine, valine, arginine, leucine, methionine, phenylalanine and tyrosine. The LC-MS/MS method has high recovery rate, repeatability, and stability in detection of serum amino acids.

recurrent spontaneous abortion; high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry; amino acid

河北省科技计划项目(122777100)。

许红(1962-)，女，主任检验师，研究方向为串联质谱在临床检验中的应用。E-mail： xuhong5618@126.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.44.005

R331

A

1002-266X(2017)44-0018-04

2017-05-17)