FAM92A1-289对人脑胶质瘤U251细胞增殖、迁移能力的影响及其与Galectin-1的关系

吴慕禹，郭兴荣，李东升

(1湖北医药学院附属太和医院，湖北十堰442000；2湖北医药学院第二临床学院)

FAM92A1-289对人脑胶质瘤U251细胞增殖、迁移能力的影响及其与Galectin-1的关系

吴慕禹1，2，郭兴荣1，李东升1

(1湖北医药学院附属太和医院，湖北十堰442000；2湖北医药学院第二临床学院)

目的探讨FAM92A1-289对人脑胶质瘤U251细胞增殖、迁移能力的影响及其与半乳糖凝集素1(Galectin-1)的关系。方法将CMV-SP6-TALEN-GFP-289质粒转染至U251细胞中，通过嘌呤霉素筛选得到稳定过表达FAM92A1-289基因的脑胶质瘤U251/289++细胞株。取脑胶质瘤U251/289++细胞作为观察组，未转染质粒的野生型U251细胞作为对照组，采用实时无标记动态细胞分析技术检测两组培养24、48、72、96、120 h的细胞增殖能力(以光密度值表示)，采用Transwell小室试验检测两组细胞迁移能力(以穿膜细胞数表示)。构建PCS2-3Flag-Galectin-1质粒，将人脑胶质瘤U251细胞随机分为FAM92A1-289组、Galectin-1组、共转染组及空白对照组，FAM92A1-289组、Galectin-1组均采用Lipofactamine 3000转染法分别转染CMV-SP6-TALEN-GFP-289质粒、PCS2-3Flag-Galectin-1质粒，共转染组同时转染上述两种质粒，空白对照组仅加入Lipofactamine 3000转染试剂。采用免疫共沉淀实验验证FAM92A1-289与Galectin-1是否存在相互作用。结果两组培养24 h光密度值比较差异无统计学意义(P>0.05)；观察组培养48、72、96、120 h光密度值均高于对照组(P<0.05或<0.01)。观察组与对照组穿膜细胞数分别为(242.0±11.41)、(65.40±7.92)个，两组比较P<0.01。共转染组抗GFP蛋白相对表达量明显高于FAM92A1-289组、Galectin-1组及空白对照组(P均<0.01)。结论过表达FAM92A1-289可提高人脑胶质瘤U251细胞增殖和迁移能力；FAM92A1-289与Galectin-1之间的相互作用可能为FAM92A1-289调控人脑胶质瘤U251细胞恶性行为的作用机制。

脑胶质瘤；U251细胞；FAM92A1-289；半乳糖凝集素1；细胞增殖；细胞迁移

脑胶质瘤占颅脑肿瘤总数的一半以上，WHO根据组织病理学标准按照恶性程度将其分为Ⅰ～Ⅳ级[1]。Ⅳ级脑胶质瘤又称胶质母细胞瘤，恶性程度最高、患者预后最差，患者经手术切除以及放化疗等综合治疗后的中位生存期仅14个月[2]。分子靶向治疗是将患者脑胶质瘤组织或瘤细胞中存在的某些特殊分子与相应抗体结合，进一步发生反应产生具有特异性的靶点，并通过该类特异性靶点有效杀死脑胶质瘤细胞[3]。FAM92A1-289是从肿瘤细胞中发现并克隆的一个FAM92A1新转录变异体基因[4]。本课题组前期研究发现，FAM92A1-289在增殖旺盛的肿瘤细胞、干细胞及癌组织中表达均较高，尤其在胚胎期脑组织中表达极高，而在正常脑组织中表达很低[5]，推测FAM92A1-289基因可能与肿瘤细胞增殖等恶性行为相关。半乳糖凝集素1(Galectin-1)是半乳糖凝集素(Galectins)家族蛋白中最先被发现的一员，其表达量与脑胶质瘤的恶性程度呈正比[6]。Galectin-1可以通过与解聚素金属蛋白酶15[7]、基质金属蛋白酶2(MMP-2)、MMP-9[8]及β1整合素[9]相互作用而提高脑胶质瘤细胞的迁移能力，通过促进血管内皮生长因子分泌而提高脑胶质瘤细胞的增殖能力[10]。故研究FAM92A1-289与Galectin-1之间的相互作用有助于加深理解FAM92A1-289对脑胶质瘤细胞增殖、迁移能力影响的可能作用机制。2016年4月～2017年4月，本研究观察了FAM92A1-289对胶质瘤细胞增殖及迁移能力的影响，现分析结果并探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 细胞：人脑胶质瘤U251细胞及人胚胎肾293T细胞均购自美国菌种典藏中心。主要试剂：DMEM培养液、Opti-MEM培养液均购自美国Gibco公司，总RNA提取TRIzol试剂购自美国LifeTechnologies公司，FastQuant cDNA第一链合成试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司，Flag Beads购自美国Sigma公司，单克隆鼠抗人Flag、GAPDH抗体及单克隆兔抗人GFP抗体均购自北京兰博利德商贸有限公司，青霉素、链霉素、胎牛血清、胰酶消化液、SDS-PAGE凝胶快速配制试剂盒、抗鼠及抗兔二抗均购自武汉碧云天生物技术有限公司。主要仪器：Transwell小室购自美国Corning公司，电转仪购自日本NEPA GENE公司，电转杯及凝胶成像系统均购自美国Bio-Rad公司。

1.2 稳定过表达FAM92A1-289基因的脑胶质瘤U251/289++细胞株构建及鉴定

1.2.1 脑胶质瘤U251/289++细胞株构建 将人脑胶质瘤U251细胞以1.0×105个/孔的密度接种于含2 mL DMEM完全培养基的6孔板中，置于37 ℃、5% CO2培养箱中孵育，取处于对数生长期的生长状态良好的细胞用于以下实验。参照本课题组前期研究[11]的方法构建带绿色荧光蛋白(GFP)的CMV-SP6-TALEN-289质粒，命名为CMV-SP6-TALEN-GFP-289质粒。将CMV-SP6-TALEN-289质粒用电穿孔的方法转染入人脑胶质瘤U251细胞内，并采用嘌呤霉素筛选出阳性细胞。方法如下：取1×106个人脑胶质瘤U251细胞与8 μg CMV-SP6-TALEN-GFP-289质粒在Opti-MEM无血清培养基中混匀，130 V电压转染后将混合液取出，加入完全培养基，置于37 ℃、5% CO2培养箱中孵育，对照孔加入未转染质粒的野生型人脑胶质瘤U251细胞。加入4 μg/μL嘌呤霉素作用10～14天，直至对照孔的野生型细胞完全死亡。取出转染CMV-SP6-TALEN-GFP-289质粒的人脑胶质瘤U251细胞，置于200倍显微镜下观察其生长情况。结果显示，转染CMV-SP6-TALEN-GFP-289质粒的人脑胶质瘤U251细胞生长状态良好，证实成功构建脑胶质瘤U251/289++细胞株。

1.2.2 脑胶质瘤U251/289++细胞株鉴定 ①GFP表达：取1.2.1中嘌呤霉素筛选得到的阳性细胞株，置于100倍荧光显微镜下观察GFP表达情况，结果显示均呈现绿色荧光，表明均正确表达GFP。②FAM92A1-289 mRNA表达：采用RT-PCR法。取1.2.1中嘌呤霉素筛选得到的阳性细胞株作为观察组，未转染质粒的野生型人脑胶质瘤U251细胞作为对照组。加入细胞裂解液，采用TRIzol试剂提取细胞总RNA，按反转录试剂盒说明书合成cDNA。以cDNA作为模板进行PCR扩增。PCR引物：FAM92A1-289上游引物：5′-GACATTAACTGGCATTGTG-3′，下游引物：5′-GCTGTGACTGTGTAGA-3′；内参β-actin上游引物：5′-ATGGCAACGGTCGACA-3′，下游引物：5′-GACGGCGACAACGCA-3′。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，共30个循环；72 ℃、10 min。采用Image Lab软件测量积分光密度(IOD)，目的基因相对表达量以FAM92A1-289基因IOD与内参β-actin IOD的比值表示。结果显示，观察组与对照组FAM92A1-289 mRNA相对表达量分别为0.596±0.026、0.059±0.006，两组比较P<0.01。③FAM92A1-289蛋白表达：采用Western blotting法。参照②的方法进行分组，提取各组细胞总蛋白，以20 μL/孔上样量进行10% SDS-PAGE蛋白分离，将电泳分离的蛋白电转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温封闭2 h；TBST洗涤3次，每次5 min；分别加入GFP抗体(1∶1 000稀释)、GAPDH抗体(1∶1 000稀释)，4 ℃孵育过夜；TBST洗涤3次，每次5 min；加入碱性磷酸过氧化物酶标记的人抗兔及抗鼠二抗(1∶1 000稀释)室温孵育2 h；TBST洗涤3次，每次5 min；将PVDF膜显影并在凝胶成像系统上成像，以GAPDH为内参，参照②的方法计算目的蛋白相对表达量。结果显示，观察组与对照组GFP-FAM92A1-289蛋白相对表达量分别为0.602±0.036、0，两组比较P<0.01。证实构建的脑胶质瘤U251/289++细胞株可稳定过表达FAM92A1-289基因。

1.3 细胞增殖能力检测 采用实时无标记动态细胞分析技术。取两组细胞，均以3×103个/孔的密度接种于含DMEM完全培养基的12孔板中。将两组细胞同时置于实时无标记动态细胞分析仪器中，设置每孔所含细胞量、细胞量监测频率及总监测时长等参数，待仪器校准后开始实时监测。记录两组细胞培养24、48、72、96、120 h的光密度(OD)值，以此表示细胞增殖能力。每组设3个复孔，取平均值。

1.4 细胞迁移能力检测 采用Transwell小室试验。取两组细胞，均计数5×104个细胞加入Transwell小室上室中，用无血清培养基正常培养，小室下加入含10%FBS的完全培养基。作用24 h，将小室取出用PBS冲洗，95%乙醇固定30 min，0.2%结晶紫染液染色1 h。显微镜下观察并拍照，随机选取5个视野计数穿膜细胞数，以此表示细胞迁移能力。每组设3个复孔，取平均值。

1.5 FAM92A1-289与Galectin-1的相互作用验证

1.5.1 PCS2-3Flag-Galectin-1真核表达质粒构建 在美国国立生物技术信息中心中查询Galectin-1基因的CDS区，设计上下游两条引物并扩增其全长序列。利用AscⅠ、FseⅠ酶对PCS2-3Flag载体和Galectin-1全长cDNA片段进行双酶切，将得到的纯化DNA片段进行连接、转化，摇菌扩大培养后，提取PCS2-3Flag-Galectin-1真核表达质粒进行质粒碱基序列测序，检测其是否存在碱基的缺失、突变等情况。双酶切及质粒碱基序列测序结果显示，质粒双酶切后分为载体和目的基因两条线性条带，各条带大小与预期相符；质粒没有任何碱基的缺失和突变，碱基序列完全正确。

1.5.2 PCS2-3Flag-Galectin-1真核表达质粒鉴定 取对数生长期的人胚胎肾293T细胞，分别转染或未转染PCS2-3Flag-Galectin-1质粒，作用24 h后提取细胞总蛋白，Flag抗体按1∶1 000稀释，Western blotting过程及目的蛋白相对表达量计算均参照1.2.2中③的方法。结果显示，转染和未转染PCS2-3Flag-Galectin-1质粒的293T细胞3Flag-Galectin-1蛋白相对表达量分别为1.678±0.065、0，两组比较P<0.01。

1.5.3 免疫共沉淀验证 将人脑胶质瘤U251细胞接种到6孔板中，待细胞长至70%～80%时，随机分为FAM92A1-289组、Galectin-1组、共转染组及空白对照组。FAM92A1-289组、Galectin-1组均采用Lipofactamine 3000转染法分别转染CMV-SP6-TALEN-GFP-289质粒、PCS2-3Flag-Galectin-1质粒，共转染组共转染上述两种质粒，空白对照组仅加入Lipofactamine 3000转染试剂。作用24 h收集各组细胞，置于250 μL含1% TritonX-100的蛋白裂解液冰上裂解，离心后取30 μL上清加入蛋白上样缓冲液，100 ℃作用10 min作为Input。将7 μL含Flag抗体的Beads颗粒分别加入剩余上清中，4 ℃摇床上过夜孵育，次日去除上清，在沉淀的Beads颗粒中加入蛋白上样缓冲液，100 ℃作用15 min作为IP。将Input和IP分别进行10% SDS-PAGE、转膜，5%脱脂奶粉封闭，加入一抗4 ℃摇床孵育过夜，加入二抗室温摇床孵育2 h后AP显影成像，记录各组蛋白条带的灰度值。

2 结果

2.1 两组细胞增殖能力比较 两组培养24 h时OD值比较差异无统计学意义(P>0.05)；观察组培养48、72、96、120 h时OD值均高于对照组(P<0.05或<0.01)。见表1。

表1 两组细胞增殖能力比较

注：与对照组比较，*P<0.05，#P<0.01。

2.2 两组细胞迁移能力比较 观察组与对照组穿膜细胞数分别为(242.0±11.41)、(65.40±7.92)个，两组比较P<0.01。

2.3 FAM92A1-289与Galectin-1的相互作用 Input中1、2号条带结果显示GFP-FAM92A1-289与3Flag-Galectin-1均得到正确表达，表示两种质粒的单转染与共转染均成功。IP中3号条带为Flag Beads骨架，为IP的内参；5号条带结果显示3Flag-Galectin-1成功结合到Flag Beads颗粒上；4号条带结果显示，共转染组抗GFP蛋白相对表达量为0.317±0.010，FAM92A1-289组、Galectin-1组及空白对照组均为0。见图1。

注：A为空白对照组；B为FAM92A1-289组；C为Galectin-1组；D为共转染组。

图1FAM92A1-289与Galectin-1蛋白相互作用的免疫共沉淀验证结果

3 讨论

脑胶质瘤是最常见的颅内肿瘤，具有高发病率、高致死率[1]。脑胶质瘤具有细胞结构混杂、增殖能力及侵袭力强、高耐药性等特性，给该疾病的临床治疗带来了巨大的挑战[2]。FAM92A1是一个高度保守的基因，目前发现其有10个转录变异体，编码一组小分子的核蛋白[4]。FAM92A1-289是Ruan等[4]2007年从肿瘤细胞中发现并克隆的一个FAM92A1新转录变异体基因，同时也是其最大的一个变异体，编码289个氨基酸核蛋白。EST分析显示，FAM92A1-289在人体发育各个阶段、多种正常组织及癌组织中均有表达[5]。而且FAM92A1-289在增殖旺盛的肿瘤细胞、干细胞及癌组织中表达较高，尤其在胚胎期脑组织中表达极高，而在正常脑组织表达很低[6]。因此，我们推断FAM92A1-289可能调控肿瘤细胞的恶性生物学行为。目前FAM92A1-289的功能仍不明确，已知的功能主要包括：①抑制肿瘤细胞增殖：采用RNAi技术下调FAM92A1-289表达可改变HeLa细胞周期分布，可使细胞阻滞于S期，表明FAM92A1-289可能通过调控细胞周期抑制肿瘤细胞增殖[13,14]；②促进肿瘤细胞增殖：肾癌OS-RC-2细胞过表达FAM92A1-289，其单克隆形成能力及裸鼠成瘤能力均显著提高[15]；白血病患者预后与该基因表达呈负相关，表明FAM92A1-289基因具有促进肿瘤增殖作用[16]。以上研究结果说明，FAM92A1-289基因可能在细胞增殖调控中发挥重要作用，但该基因是促进还是抑制细胞增殖目前还存在争议。

目前关于FAM92A1-289基因在脑胶质瘤发生、发展中的作用鲜见报道。本研究通过体外转染质粒、嘌呤霉素筛选及mRNA、蛋白两个水平的分子鉴定，最终成功构建了稳定过表达FAM92A1-289的胶质瘤U251/289++细胞株，并观察其对胶质瘤细胞增殖和侵袭能力的影响。结果显示，观察组培养48、72、96、120 h OD值均高于对照组，观察组穿膜细胞数高于对照组；表明稳定过表达FAM92A1-289能明显促进胶质瘤U251细胞的增殖及迁移能力，提示FAM92A1-289是一个促进脑胶质瘤细胞增殖与迁移的基因。

前期研究中酵母双杂交实验发现，FAM92A1-289可能与Galectin-1存在相互作用[12]。Galectin-1属于Galectin家族蛋白，广泛存在于人体组织及细胞内，可与半乳糖苷特异性结合，在细胞黏附、增殖、凋亡等多种病理生理过程中发挥重要作用[17]。大量研究发现，Galectin-1在许多肿瘤组织中表达明显上调，并且其表达量的改变与肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭性能力有关[18～22]。为了进一步探讨FAM92A1-289调控U251细胞增殖和迁移能力的作用机制，我们利用免疫共沉淀验证Galectin-1与FAM92A1-289是否存在相互作用。结果显示，共转染组抗GFP蛋白相对表达量明显高于FAM92A1-289组、Galectin-1组及对照组，证实Galectin-1存在时FAM92A1-289才能被共沉淀，表明FAM92A1-289与Galectin-1在真核细胞内存在相互作用。

综上所述，过表达FAM92A1-289可提高脑胶质瘤U251细胞增殖和迁移能力，FAM92A1-289与Galectin-1之间的相互作用可能是FAM92A1-289调控脑胶质瘤细胞恶性行为的作用机制。

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EffectsofFAM92A1-289onproliferationandmigrationofgliomacellsU251anditsrelationshipwithgalectin-1

WUMuyu1,GUOXingrong,LIDongsheng

(1TaiheHospital,HubeiUniversityofMedicine,Shiyan442000,China)

ObjectiveTo explore the function of FAM92A1-289 in regulating the proliferation and migration of glioma cells U251 and its relationship with galectin-1.MethodsWe transfected the plasmid CMV-SP6-TALEN-GFP-289 into U251 cells, and used puromycin to get the stable cell line U251/289++with over-expression of FAM92A1-289 gene. We took U251/289++cells as the observation group, and U251 cells without transfection as the control group. The real-time cell analysis (RTCA) technology was used to detect the cell proliferation ability of the two groups (expressed by the optical density value) at 24, 48, 72, 96, and 120 h; Transwell test was used to detect the cell migration ability of the two groups (expressed by the number of cells crossing the trans-well chamber). We constructed the PCS2-3Flag-Galectin-1 plasmid, and the U251 cells were randomly divided into FAM92A1-289 group, the Galectin-1 group, co-transfection group, and control group. In the FAM92A1-289 group and Galectin-1 group, we used the Lipofactamine 3000 transfection method to transfect CMV-SP6-TALEN-GFP-289 and PCS2-3Flag-Galectin-1 plasmids, respectively. The cells in the co-transfection group were transfected with the two plasmids, and in the control group we only added Lipofactamine 3000 transfection reagent. The interaction between FAM92A1-289 and Galectin-1 protein was verified by Co-Immunoprecipitation.ResultsThere was no statistically significant difference between the two groups cells at 24 h (P>0.05). The optical density value at 48, 72, 96 and 120 h was significantly higher than that in the control group (P<0.05 orP< 0.01). The number of cells crossing the chamber in the observation group and the control group were 242.0±11.41 and 65.40±7.92, respectively (P<0.01). The relative expression of GFP in co-transfection group was significantly higher than that in the FAM92A1-289 group, Galectin-1 group, and control group (P<0.01).ConclusionThe over-expression of FAM92A1-289 can improve the proliferation and migration of U251 cells, and the interaction between FAM92A1-289 and galectin-1 is used to provide evidence for the role of FAM92A1-289 in regulating the malignant behavior of glioma cells.

glioma; U251 cells; FAM92A1-289; galectin-1; cell proliferation; cell migration

国家自然科学基金应急管理项目(81641028)；湖北省自然科学基金面上项目(2016CFB408)。

吴慕禹(1992-)，男，硕士在读，研究方向为脑胶质瘤的基础和临床。E-mail： 315971175@qq.com

李东升(1960-)，男，教授，研究方向为脑胶质瘤的基础和临床。E-mail： dsli1698@126.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.44.003

R739.41

A

1002-266X(2017)44-0009-05

2017-05-15)