紫苏叶对红曲菌产色素和莫纳可林K及抗氧化物的影响

卢绍闯,胡琳慧,冯艳丽*

(1.湖北师范大学 食用野生植物保育与利用湖北省重点实验室,湖北 黄石 435002;2.湖北师范大学 生物学国家级实验教学示范中心,湖北 黄石 435002)

紫苏叶对红曲菌产色素和莫纳可林K及抗氧化物的影响

卢绍闯1,2,胡琳慧1,2,冯艳丽1,2*

(1.湖北师范大学 食用野生植物保育与利用湖北省重点实验室,湖北 黄石 435002;2.湖北师范大学 生物学国家级实验教学示范中心,湖北 黄石 435002)

以高产莫纳可林K(MK)及红曲色素(MPs)、不产桔霉素的丛毛红曲菌(Monascus pilosus)MS-1为实验菌株,优化已有的固态发酵工艺,考察添加紫苏叶对红曲菌产MPs、MK及抗氧化物的影响。结果表明,添加10%紫苏叶时MPs和MK的产量最高(P＜0.05)。添加紫苏叶及紫苏叶提取液均可显著促进菌株MS-1产MPs和MK(P＜0.05),但两种添加方式对菌株MS-1产MPs及MK的影响无显著差异(P＞0.05)。添加紫苏叶后色价和MK产量可分别达211.73 U/g和8.15 mg/g,分别为对照的1.35和1.36倍。紫苏红曲粗提物的DPPH清除率显著高于对照(P＜0.05),可达48.71%。然而,紫苏红曲中迷迭香酸含量仅为0.032 mg/g,而紫苏叶中迷迭香酸含量高达14.71 mg/g。添加紫苏叶不仅可促使红曲菌产MPs及MK,还可能促使红曲菌产抗氧化物质,从而提高其发酵产物的抗氧化能力。

紫苏叶;红曲菌;红曲色素;莫纳可林K;抗氧化

紫苏(Perillae frutescensL.)为唇形科(Labiate)一年生草本植物,为喜温短日性植物。因其适应性较强,作为多用途经济作物在我国已有2 000多年的栽培历史[1]。紫苏在我国北方主要是油用,而在南方则兼作香料和食用[2]。紫苏的叶、茎、苞和籽均可入药,其中紫苏叶具有抗过敏、抗氧化、抗微生物、抗肿瘤和抗癌等功效,主要是紫苏叶中含有大量多酚类化合物如迷迭香酸、儿茶素、芹菜素和木犀草素等[2]。另外,紫苏叶中还含有8种人体必需氨基酸和4种微量元素,其中含量较高的为亮氨酸和天冬门氨基酸[3]。而紫苏叶中粗蛋白的含量也高达27.8%,远远超过普通蔬菜的含量[4]。红曲菌(Monascusspp.)又称为红曲霉,是我国重要的药、食同源微生物。其可产生丰富的功能性次级代谢产物,如莫纳可林K(monacolin K,MK)、红曲色素(Monascus pigments,MPs)、γ-氨基丁酸、Dimerumicacid等[5-10],其中MK则具有调节血脂的功能;MPs主要用作天然着色剂;γ-氨基丁酸参与多种代谢活动,具有很高的生理活性;Dimerumic acid是一种抗氧化剂。添加紫苏叶对红曲菌其他代谢产物产生的影响仍不清楚。肖翔等[11]将紫苏叶提取物添加到红曲菌GM075发酵培养基中,结果表明,添加超声法提取的紫苏叶提取物可显著提高红曲发酵产抗氧化活性物质Dimerumic acid,红曲发酵液的自由基清除活性也显著提高。代沙[12]测定了不同紫苏品系和不同产地紫苏叶总多酚、总黄酮、总皂苷和原花青素含量,同时测定了其各自总还原能力、清除·OH、超氧阴离子以及抑制脂质过氧化的能力;分析了其醇提物中部分单体酚类物质组成及含量。甘锋等[13]将紫苏叶提取液添加至红曲菌发酵培养基中,制得的抗氧化红曲中含有多种生理活性物质,其中Dimerumic acid达到3.1 mg/g,含有紫苏黄酮2.5 mg/g,具有很好的保健作用。

本研究以一株可高产MK不产桔霉素的丛毛红曲菌(Monascuspilosus)MS-1为实验菌株,以优化后的红曲固态发酵工艺为基础,考察添加紫苏叶对红曲菌固态发酵过程中产MPs及MK的影响,并通过分析1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)清除率的方法对所制得的紫苏红曲的抗氧化能力进行评估。以期为紫苏叶及红曲的综合利用提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 原料与菌株

丛毛红曲菌(Monascus pilosus)MS-1:中国典型培养物保藏中心,编号CCTCC M 2013295,由市售红曲产品中分离获得。紫苏叶:河北楚风中药饮片有限公司。

1.1.2 化学试剂

MK、迷迭香酸标准品(纯度≥98%):上海阿拉丁生化科技股份有限公司;DPPH自由基:美国Sigma公司;乙腈(色谱纯)、葡萄糖、蛋白胨、琼脂、冰醋酸、磷酸二氢铵、MgSO4·7H2O、氯化钙、抗坏血酸、无水乙醇、Tris-HCl缓冲液(均为分析纯):国药集团化学试剂有限公司。

1.1.3 培养基

马铃薯葡萄糖琼脂(potato dextrose agar,PDA)培养基[14]:将马铃薯去皮,称取200 g,切成约2 cm2的小块,放入锅中煮沸30 min,然后用双层纱布过滤,取其滤液加葡萄糖20 g,用蒸馏水补足至1 000 mL,自然pH,加入20 g琼脂粉,充分搅拌,分装至茄子瓶中,每瓶装约120 mL。

种子培养基[14]:添加80 g/L葡萄糖,0.01 g/L蛋白胨,0.002 g/L磷酸二氢铵,0.000 5 g/L MgSO4·7H2O,0.000 1 g/L氯化钙,以土豆汁代替蒸馏水定容,并将pH调至5.5。

固态发酵培养基[14]:将50 g细度为20目的物料(米粉30 g,豆粉20 g)加入250 mL三角瓶中,分别调整培养基含水量、乙酸含量及MgSO4·7H2O为35%、0.6%和0.004mol/kg,混匀、灭菌,冷却。

以上培养基灭菌条件为121℃、20 min。

1.2 仪器与设备

UV-5100 B紫外分光光度计:上海元析仪器有限公司;Agilent 1260高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)仪:安捷伦科技有限公司;Anke TJL-18G-C离心机:上海安亭科学仪器厂;HZQ-F160振荡培养箱:哈尔滨市东联电子技术开发有限公司;SENCO R旋转蒸发器系列:上海申生科技有限公司;FD-1A-50冷冻干燥机:北京博医康实验仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 红曲样品中MPs及MK的测定

红曲样品中MPs及MK的分析方法参考已建立的方法进行[14]。在50 mL的离心管中加入0.3 g红曲固态发酵产物,加入10 mL体积分数为75%的乙醇溶液,超声提取1 h,放入8 000 r/min的离心机中离心10 min,取上清液,采用分光光度法在波长505 nm处测定吸光度值,色价计算公式如下:

上述离心后的上清液,过0.22 μm滤膜后采用高效液相色谱法测定红曲样品中的MK。MK标准品的制备参考已发表的方法进行[15]。采用Agilent 1260进行HPLC分析。HPLC检测条件为InertsilODS-3色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),流动相为乙腈∶水∶0.5%磷酸=(60∶37∶3,V/V),流速1 mL/min,柱温25℃,检测波长238 nm,进样量20 μL。红曲样品中MK含量的计算公式为:

1.3.2 紫苏叶添加量对红曲菌固态发酵产MPs和MK的影响

在优化的固态培养基中添加紫苏叶干粉,并分别将紫苏叶干粉添加量调整为10%、20%、30%、40%,以不添加紫苏叶干粉的处理为对照。在固态培养基中接入13%种子液(30℃培养36 h),在30℃条件下培养60 h后转入25℃的培养箱中继续培养至14 d。将所得红曲发酵产物在55℃烘干并粉碎至细度为80目。采用分光光度法分析上述样品的色价,采用HPLC法分析MK的含量。

1.3.3 紫苏叶添加方式对红曲菌固态发酵产MPs和MK的影响

在优化的固态培养基中添加紫苏,分别以添加紫苏叶干粉和紫苏浸提液(紫苏叶干粉和水料液比1∶5(g∶mL)在60℃浸提2 h,过滤),以不添加紫苏的处理作为对照。接种量、培养条件及样品烘干方法及发酵产物的色价、MK含量的测定方法同1.3.2。

1.3.4 紫苏红曲与常规红曲粗提物清除DPPH效果对比[16]

紫苏红曲提取物制备:在1 L三角瓶中按1∶10(g∶mL)料液比加入紫苏红曲和体积分数为80%的乙醇溶液,置于60℃恒温水浴1 h,过滤,取上清液在80℃真空旋转蒸发,所得固形物置于平皿中冷冻24 h。待冷冻完全后置于冷冻干燥机干燥约24 h得到粉末状粗提物。

溶液的配制:Tris-HCl(pH 7.40,50 mmol/L)缓冲液,0.1 mmol/L DPPH无水乙醇溶液,6 mg/mL样品,用体积分数为80%的乙醇溶液溶解,维生素C(vitamin C,VC)的质量浓度也调整至6 mg/mL[16]。

按表1加样,混合均匀,室温条件下放置30 min,在波长517 nm处测定吸光度值。以VC作阳性对照,按以下公式计算清除率:

表1 清除DPPH实验加样表Table 1 Adding sample table of clearing DPPH experiments

1.3.5 紫苏叶及紫苏红曲中迷迭香酸含量的测定

红曲样品中迷迭香酸的提取方法同MPs及MK的提取,采用改进后的HPLC法检测迷迭香酸的含量。采用体积分数为80%的乙醇为溶剂,将迷迭香酸标准品配制成1 mg/mL的标准溶液。HPLC系统同1.3.1,流动相为甲醇∶0.5%磷酸=(60∶40,V/V),流速1 mL/min,柱温25℃,检测波长330 nm,进样量10 μL。迷迭香酸含量的计算公式如下:

2 结果与分析

2.1 紫苏叶添加量对红曲菌固态发酵产MPs和MK的影响

为考察紫苏叶添加量对红曲菌固态发酵产MPs及MK的影响,以不添加紫苏的处理作为对照,发酵14 d后检测发酵产物的色价及MK含量,结果如图1所示。

图1 紫苏叶添加量对菌株MS-1产MPs(A)及MK(B)产量的影响Fig.1 Effect of perilla leaf addition on MPs(A)and MK(B)production by strain MS-1

由图1A可知,添加10%紫苏叶后可显著促进红曲菌MS-1产MPs(P＜0.05),当紫苏叶添加量为10%时,色价达到120 U/g,是对照的1.74倍。当添加20%和40%的紫苏叶时,和对照组相比色素产量有所下降。而添加30%紫苏叶的色素和对照组相比无显著性差异(P＞0.05)。由图1B可知,当紫苏叶添加量为10%时,对MK的产量也有显著促进作用(P＜0.05),MK产量可达到对照的1.70倍。当紫苏叶添加量为20%、30%和40%时,对MK的产量均有显著抑制作用(P＜0.05)。综合考虑紫苏叶对MPs及MK产量的影响,选择添加10%的紫苏叶开展后续实验。

2.2 紫苏叶添加方式对红曲菌固态发酵产MPs和MK的影响

为考察紫苏叶添加方式对菌株MS-1固态发酵产MPs及MK的影响,以不添加紫苏叶的处理作为对照,发酵14 d后检测发酵产物的色价及MK含量,结果如图2所示。

图2 紫苏叶添加方式对菌株MS-1产MPs(A)及MK(B)的影响Fig.2 Effect of adding method of perilla leaf on MPs(A)and MK(B)production by strain MS-1

由图2可知,添加10%紫苏叶干粉和10%紫苏叶提取液,对菌株MS-1产MPs和MK均有显著促进作用(P＜0.05)。然而,两种不同的添加方式之间并无显著性差异(P＞0.05)。添加紫苏叶后色价和MK产量可达211.73 U/g和8.15 mg/g,分别为对照的1.35和1.36倍。与“紫苏叶添加量”批次的实验相比,添加紫苏叶对MPs和MK的促进作用有所减弱。可能是发酵实验自身的不稳定性以及不同批次菌种的活力不同造成的。但总体来说,紫苏叶对红曲固态发酵产MPs及MK均呈促进作用,且MK的产量相对稳定。

2.3 紫苏红曲与常规红曲粗提物清除DPPH效果对比

为考察添加紫苏叶对红曲菌固态发酵产物清除DPPH效果的影响,以不添加紫苏的处理作为对照,培养14 d,发酵产物经提取、过滤、旋转蒸发、冷冻干燥后得粗提物(100g红曲样品得到约1 g粗提物),分别测定紫苏红曲和常规红曲DPPH的清除率,结果如图3所示。

图3 不同样品对DPPH清除率的影响Fig.3 Effect of different samples on the clearance rate of DPPH

由图3可知,紫苏红曲粗提物的DPPH的清除率显著高于对照(P＜0.05),其清除率高达48.71%。以VC作阳性对照,VC的DPPH清除率可达到76.75%。由于紫苏红曲和常规红曲的粗提物中能起到抗氧化作用的组分复杂,目前已证实具有抗氧化作用的物质除了Dimerumic acid还有红色素和橙色素[16]。本实验所采用的紫苏红曲样品色价为对照的1.35倍,紫苏红曲粗提物对DPPH的清除率为常规红曲粗提物的1.63倍。

2.4 紫苏叶及紫苏红曲中迷迭香酸含量的测定

为进一步分析紫苏红曲与常规红曲抗氧化能力提高的原因,采用HPLC法分析了紫苏叶及紫苏红曲中迷迭香酸的含量,结果如表2所示。

表2 紫苏叶及紫苏红曲中迷迭香酸含量对比Table 2 Comparison of contents of rosmarinic acid in perilla leaf and perillaMonascus

由表2可知,紫苏叶中迷迭香酸含量远远大于紫苏红曲中迷迭香酸含量,呈现极显著差异(P＜0.01),紫苏叶中迷迭香酸含量高达14.71 mg/g。根据已有文献推测[11],在发酵过程中红曲菌可能利用了迷迭香酸,紫苏红曲的抗氧化作用并非由于迷迭香酸的功能,而是红曲菌发酵过程中产生的抗氧化物质。

3 结论

本研究考察了添加紫苏叶对红曲菌在固态发酵条件下产MPs及MK的影响,分析了常规红曲及紫苏红曲的抗氧化能力和影响其抗氧化能力的原因。结果表明,在红曲菌固态发酵培养基中添加紫苏叶可显著促进红曲菌产MPs及MK,并可提升红曲菌发酵产物清除DPPH的能力。经分析,紫苏红曲中迷迭香酸含量仅为0.032 mg/g,推测红曲菌利用了部分迷迭香酸。与对照相比,推测紫苏红曲表现出的高抗氧化能力并非是紫苏叶主要功效成分迷迭香酸所起的作用,而是由于添加紫苏叶促进了红曲菌抗氧化成分如Dimerumic acid及红曲色素等的产生。综上,添加紫苏叶不仅可促进红曲菌固态发酵产MPs和MK,还可促进红曲菌产生抗氧化物质。该研究结果可为新型红曲产品如紫苏红曲的开发及紫苏的综合利用提供新的思路。

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LU Shaochuang1,2,HU Linhui1,2,FENG Yanli1,2*
(1.Hubei Key Laboratory of Edible Wild Plants Conservation and Utilization,Hubei Normal University,Huangshi 435002,China;2.National Demonstration Center for Experimental Biology Education,Hubei Normal University,Huangshi 435002,China)

TS201.3

0254-5071(2017)11-0101-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.11.022

2017-08-08

湖北省重点实验室开放基金项目(EWPL2017)

卢绍闯(1993-),男,本科生,研究方向为食品生物技术。

*通讯作者:冯艳丽(1981-),女,副教授,博士,研究方向为食品微生物。