不同诱导因子对灵芝菌液体发酵的影响研究进展

张蕊多,刘焕焕,郭 枫,辛 宇,邱智东,王伟楠*

(长春中医药大学 药学院,吉林 长春 130117)

不同诱导因子对灵芝菌液体发酵的影响研究进展

张蕊多,刘焕焕,郭 枫,辛 宇,邱智东,王伟楠*

(长春中医药大学 药学院,吉林 长春 130117)

灵芝是我国著名的药食两用真菌,近年来对灵芝菌丝体的液体发酵研究取得了较好的成果。该文综述了不同种类的诱导因子(无机盐、生长因子及非必须营养因子等)对灵芝液体发酵的影响,旨在提高灵芝液体发酵产物的品质,为灵芝液体发酵培养条件的优化研究奠定理论基础,以及为灵芝液体发酵技术的推广应用提供参考。

灵芝;液体发酵;诱导因子;无机盐;研究进展

灵芝(Ganoderma lucidum)古时亦称“仙草”、“瑞草”,是担子菌纲多孔菌目灵芝科灵芝属真菌,始载于《神农本草经》,具有益心气、安精魂、补肝益气、坚筋骨的功效。灵芝的菌丝、孢子和子实体均可利用,现代药理研究表明,其主要生物活性成分有多糖类、三萜类、多肽类、甾醇类、核苷类和生物碱类等[1],对于增强人体免疫力,调节血糖、血压,辅助肿瘤放、化疗,保肝护肝,治疗慢性支气管炎、冠心病,促进睡眠等均具有显著作用[2-3]。

传统栽培灵芝因环境因素和生长条件难以控制,子实体中活性成分质量不稳定且生产效率低。目前利用现代生物技术通过液体发酵生产灵芝菌丝体,工艺简便、材料易得、副产物少、占空间少、周期短(10～12 d)、产量高,可在短时间内大规模生产,为集约化、标准化、工业化的灵芝活性成分开发创造有利条件[4-5]。液体发酵中培养基是灵芝赖以生存的环境,近年来研究表明[6-8],除了碳源和氮源,不同成分、比例的诱导因子对灵芝菌丝的生长状态、得率及活性成分含量有着重要的影响。

液体发酵中的诱导因子包括无机盐、生长因子及非必须营养因子等。无机盐是灵芝深层液体发酵中必不可少的一类营养物质,它们是酶活性中心的组成成分和酶的激活剂,参与调节细胞渗透压、控制细胞氧化还原电位、维持细胞结构的稳定性;生长因子是一些特殊的相对分子质量小的有机化合物,与灵芝活性成分代谢有着密切的关系;其他非必需营养因子如脂肪酸、茉莉酸甲酯、水杨酸、褪黑素、木质素、中药提取物等,它们添加到培养基后可改善灵芝菌体生长极差的状态。因此对培养基中诱导因子的探讨也是提高灵芝生物量、灵芝多糖和灵芝酸产量的必要过程[9-12]。

本文通过综述了不同诱导因子对灵芝菌液体发酵的影响,以明确目前灵芝液体发酵领域中所应用的各种不同诱导因子(无机盐、生长因子和非必需营养成分)在灵芝生物量积累、灵芝多糖以及灵芝酸的生物合成过程中所扮演的角色。

1 无机盐对灵芝液体发酵的影响

1.1 磷、钾、镁元素

灵芝在液体发酵过程中需要添加无机盐使菌丝正常生长,最基本元素为磷、钾和镁[13]。磷参与糖代谢,影响菌体的呼吸作用;镁存在于细胞膜和细胞壁中,参与菌体生长,含量太少会影响碳源的氧化;钾是灵芝酸合成过程中各种酶的激活剂,可以维持细胞内酸碱平衡,同时还为菌体生长供应适宜的渗透压环境[14-16]。

金德宽[17]探讨了不同培养基组成对灵芝菌丝体生物量和灵芝酸产量的影响,结果表明,随着培养基中K2HPO4和MgSO4质量浓度的增加,菌丝体生物量和灵芝酸产量均有所增加;但当MgSO4质量浓度＞1.5 g/L后,灵芝酸的产量则呈下降的趋势。张冬雪等[18]考察了不同无机盐对灵芝菌合成β-葡聚糖的影响,发现添加K2HPO4后,β-葡聚糖得率最高且明显高于其他无机盐,并通过浓度梯度试验确定,当K2HPO4质量浓度≤1.5 g/L时,β-葡聚糖得率随K2HPO4质量浓度增加而增大。张璐等[19]在固定碳源和氮源的前提下,分别改变无机盐的浓度梯度进行培养,结果表明,不同质量浓度无机盐的添加对于灵芝多糖的产生均有一定的正向促进作用,在以1.5 g/L MgSO4为无机盐的培养基中胞外多糖得率最大,进一步通过响应曲面分析试验得出蛋白胨与MgSO4的交互作用对胞外多糖产量有显著影响。以上结果表明,添加一定质量浓度的P、K和Mg元素可以促进灵芝菌丝体生长并提高胞外代谢物产量。

1.2 钙、铁、锰元素

钙、铁、锰元素在液体深层发酵中也有着至关重要的作用。钙离子有调节细胞通透性的作用,可调节培养液中磷酸盐的含量,与细胞壁的稳定性有关;铁离子是细胞色素、细胞色素氧化酶和过氧化氢酶等的组分,是细胞色素和氧化还原反应必不可少的电子载体,在电子传递体系中起至关重要的作用[20];锰元素参与过氧化物歧化酶的活动,也是磷酸烯醇式脱羧酶、柠檬酸合成酶的辅助因子[21]。

蔡爱群等[22]以赤芝和松杉灵芝为研究对象,开展了不同含量的Ca2+、Fe2+、Mn2+对灵芝菌丝体生物量影响的实验研究。由于不同品种的灵芝对微量元素的敏感程度不同,因此在液体发酵过程中根据不同菌株的特性适量添加无机盐。在200～1 200 mg/L范围内,随着Ca2+质量浓度的增加,赤芝生物量逐渐减少,而松杉灵芝在Ca2+质量浓度为200 mg/L时生物量最高,之后出现生长抑制现象,其生物量低于空白对照组;当Fe2+质量浓度在200～600 mg/L范围内时,赤芝和松杉灵芝的生物量均高于空白对照组,若质量浓度超过此范围,两种灵芝的生物量明显降低;当Mn2+质量浓度为400mg/L时,两种灵芝的生物量均达到最高。熊艳森等[23]研究不同含量Ca2+、Fe2+对液体摇床培养灵芝的菌丝体生长、胞外多糖及菌丝体钙、铁含量的影响时发现,灵芝胞外多糖含量和菌丝体中钙含量最高的最适Ca2+含量为200 mg/L。当发酵液中Fe2+含量为1 000 mg/L时,灵芝胞外多糖和菌丝体中铁含量最高。李宇伟等[24]考察了Fe2+含量对灵芝多糖生物合成的影响,结果表明,当液体培养基中Fe2+含量达到0.2%时,灵芝多糖产量最高,为6.216 g/L,每克干菌丝产胞内粗多糖达428.9 mg。叶丽云等[25]在灵芝的液体培养基中加入10 mol/L Ca2+诱导后,灵芝酸的含量比对照组提高了64%,多糖含量提高了34%。XU Y N等[26]发现Mn2+通过调节钙调神经磷酸酶信号转导改善灵芝酸产量,在培养基中加入10 mmol/L的MnCl2,12 d时灵芝菌丝的生物量及灵芝酸产量均达到最高。

1.3 锌、铜、硒、稀土元素

在微生物细胞生长繁殖过程中,锌、铜、硒、稀土元素也可以作为其生理活性物质的组成或生理活性作用的调节物。锌离子参与乙醇脱氢酶、乳酸脱氢酶、碱性磷酸酶、醛缩酶、核糖核酸(ribonucleic acid,RNA)与脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid,DNA)聚合酶的活动;铜离子存在于细胞色素氧化酶中,参与加氧酶的活动;硒参与甘氨酸还原酶和甲酸脱氢酶的活动;稀土元素具有广泛的生物学功能,能够促进植物的生长以及细胞次生代谢产物的合成[27-29]。

谭才邓等[30]实验证明,低含量的Zn2+可以促进灵芝菌丝生长和灵芝多糖合成,当Zn2+含量为0.01%时,菌丝体生物量最高为6.38 g/L,菌丝多糖含量可达4.92%;但随着Zn2+含量的升高,菌丝生长受到不同程度的抑制。魏赛金等[31]研究了不同Zn2+添加量对灵芝液体培养富锌的影响,结果显示菌丝体锌含量随着培养液中Zn2+添加量的增加而有上升趋势,当Zn2+添加量为300mg/L时,菌丝体的富锌能力最强,含锌量高达25.09mg/g,锌元素的富集增长率达到135.14%,胞外多糖含量为57 g/L;但当Zn2+添加量超过300 mg/L时,随着Zn2+添加量的增加,灵芝菌丝体中锌含量显著下降。鲍锐[32]采用单因素法研究了Cu2+对灵芝深层发酵的影响,实验发现加入100 μmol/L硫酸铜时,灵芝酸产量较对照组提高57%,达到207.773 mg/L。ZHU L W等[33]为了进一步增强灵芝酸的积累,采用Cu2+的添加、三阶段光照射和多脉冲培养策略,获得最大灵芝酸含量(即4.1 mg/100 mg干质量)和产量(即720.8 mg/L)。胡志斌等[34]就不同水平的亚硒酸钠对灵芝液体发酵的影响进行了研究,数据显示,在含硒250 mg/L发酵液中菌丝体生物量最高,且富硒后的菌丝体其他金属元素含量没有呈现规律性的变化;300 mg/L发酵液中富硒率最高,但之后随着硒含量的升高灵芝菌发生硒中毒现象,生物量大幅度下降。姚强等[35]试验发现不同浓度的稀土元素能一定程度上促进灵芝多糖和灵芝三萜的合成,其中镨元素促进灵芝胞内多糖、胞外多糖和胞内三萜生产的效果显著,镧元素诱导合成的胞外三萜效果最好。

由此可见,灵芝液体深层发酵过程对诱导因子的需求不尽相同,有的无机盐如果过量会对细胞产生毒害作用,因此有必要将培养基中诱导因子的量控制在正常范围内,并注意各种无机盐之间保持恰当的比例。

2 生长因子对灵芝液体发酵的影响

维生素作为灵芝液体发酵培养基中的生长因子,常以辅酶或辅基形式参与生物催化剂——酶系的活动,以及促进甲基的形成和转移,参与细胞的糖代谢、蛋白质代谢、脂肪代谢等重要生命活动[36]。常加入的维生素有维生素B1(vitamin B1,VB1)、维生素B2(vitamin B2,VB2)、维生素B12(vitamin B12,VB12)等。

在灵芝发酵培养基中添加适量的维生素类物质,对菌丝体的生长和胞外多糖的合成有正向促进作用。曾晓希等[37]开展了维生素B族对灵芝液体发酵影响的试验研究,分别将维生素B1、B2和B6添加到培养基中。研究结果表明三种维生素B对灵芝的生长和胞外多糖的积累均有正向促进作用。其中维生素B1的效果最显著,生物量和胞外多糖分别达到7.604 g/L和0.863 g/L。陈芳莉等[38]通过对灵芝菌丝体液体发酵产胞外多糖条件的优选,发现添加维生素B2和B6均能促进菌丝体生长,获得较多的胞外多糖。其中维生素B2的促进作用更为明显。吴保锋等[39]采用食用菌菌丝液体培养方法,重点分析不同生长因子对灵芝菌丝生长的影响。通过不同生长因子处理组间的Duncan's多重比较结果可知,5种生长因子对灵芝菌丝生长的促进作用大小依次为:维生素B12＞维生素B2＞维生素C＞复合维生素B＞维生素B6。

3 非必需营养因子对灵芝液体发酵的影响

据相关报道,脂肪酸、茉莉酸甲酯、水杨酸、褪黑素、木质素等非必需营养因子对灵芝液体发酵中菌丝体的生长和代谢产物合成也有着不同的影响。

3.1 脂肪酸

试验研究表明[36],脂肪酸可促进米曲霉、枝顶孢霉等真菌在液体发酵过程中产生多糖、黄曲霉毒素等代谢产物,各种脂肪酸对灵芝液体发酵的不同代谢产物也有着不同的影响。

朱会霞[40]采用L18(37)正交试验设计对灵芝液体发酵培养基进行了优化研究。结果表明,α-萘乙酸、油酸、L-谷氨酸为影响灵芝真菌发酵产灵芝酸的显著性因素。孙金旭等[41]研究发现α-萘乙酸、油酸、L-谷氨酸作为诱导因子都能使灵芝菌丝体产量及多糖产量有不同程度的提高。添加1 g/L的油酸,菌丝体产量增加49.93%,多糖产量提高60%。同时添加3种生长因子对菌体及多糖产量都有影响,油酸影响显著,3种因子添加的适宜组合为α-萘乙酸0.1 mg/L、油酸1 g/L、L-谷氨酸1.5 g/L,在此条件下,菌体最大产量提高76.65%,多糖产量提高95%。姚强等[42]通过研究硬脂酸、亚油酸和棕榈酸对灵芝液体发酵的影响发现,硬脂酸和亚油酸分别对于胞外多糖和胞内多糖的合成具有较好的促进作用;在灵芝三萜类物质的发酵合成过程中,亚油酸促进作用最强,硬脂酸和棕榈酸则具有一定的抑制作用。

3.2 茉莉酸甲酯

茉莉酸甲酯是一种广泛存在于植物体内的植物激素和信号分子,其外源性加入可以诱导多种防御基因的表达和代谢产物的合成,目前已有文献报道了茉莉酸甲酯对灵芝酸的生物合成有正向促进作用。CHOI D W等[43]为了提高灵芝酸的产量,使用均匀设计法来优化有利于灵芝酸生物合成的条件,培养6 d之后在吐温中加入254 μmol/L的茉莉酸甲酯,得到的灵芝酸产量为45.2 mg/100 g,较空白对照组提高45.3%。DING Y X等[44]在灵芝酸生物合成的关键基因FPPs中找到了两个潜在的茉莉酸甲酯响应区域,这说明基因FPPs可能参与了灵芝酸生物合成途径中茉莉酸甲酯的信号传导过程,为茉莉酸甲酯影响灵芝酸合成的机理阐述提供了理论依据。SHANGCH等[45]发现,不同浓度茉莉酸甲酯对灵芝酸生物合成关键基因Gl-OSC的表达量有不同程度的调节作用,当茉莉酸甲酯的加入量达到200μmol/L时,其表达量达到最高。RENA等[46]利用实时定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)技术对茉莉酸甲酯诱导下的多种灵芝酸生物合成基因表达情况进行了考察,结果表明,基因Gl-HMGS、Gl-HMGR、Gl-MVD、Gl-FPPs、Gl-SQS和Gl-OSC在茉莉酸甲酯的诱导下,表达量均有一定程度的提高,提示在加入茉莉酸甲酯的情况下,灵芝酸的产量会有一定程度的提高。以上这些趋势与之前的很多研究报道[47]一致,进一步确证了茉莉酸甲酯可以促进对灵芝酸的生物合成,也为茉莉酸甲酯在灵芝酸工业合成领域的应用提供了参考。

3.3 中药提取物

近年来研究发现,向灵芝液体培养基中加入某些中药可以作为提高灵芝酸产量的一种稳定手段。朱强等[48]对比了不同中药提取物对灵芝生长和代谢产物合成的影响,发现甘草对胞外灵芝酸的合成有正向促进作用,山茱萸既能促进灵芝菌体快速生长,又可以促进灵芝胞外多糖的合成。刘媛等[49]报道结果表明,金银花、淡豆豉、淡竹叶、连翘和甘草对菌体的生长及灵芝酸的含量的增加具有显著效果。刘高强等[50]开展了不同药用昆虫对灵芝多糖生物合成影响的试验研究。结果显示,5 g/L的药用蜣螂能显著促进灵芝胞内多糖和胞外多糖的形成(P＜0.05)。胞内多糖和胞外多糖的产量分别由(1.93±0.09)g/L和(520.3±20.2)mg/L提高至(2.41±0.12)g/L和(608.9±20.2)mg/L,且培养基中灵芝多糖中没有出现新组分,即灵芝多糖的主要合成途径并未改变。

3.4 其他非必须营养因子

水杨酸作为酚类化合物可提高抗氧化酶活力,促进抗病蛋白的合成,调节基因的表达并参与胞内信号传导[51-52]。

叶丽云等[25]研究表明浓度为150 μmol/L的水杨酸不同诱导时间对灵芝多糖和三萜均有显著影响,在诱导的前期能促进灵芝多糖和三萜的合成,随着诱导时间的增加诱导作用减弱,甚至产生抑制作用,并且试验进一步阐明了其促进灵芝酸生物合成的机理,即水杨酸提高了灵芝三萜在合成过程中鲨烯合酶(squalene synthase,SQS)、羊毛脂醇合酶(lanosterol synthase,LS)和法尼基焦磷酸合酶(farnesyl pyrophosphate synthase,FPS)基因的表达量。鲍锐等[32]采用单因素试验考察了褪黑素灵芝深层发酵的影响,结果表明,加入20 μmol/L褪黑素时,灵芝酸产量较对照组提高73%,达到244.528 mg/L。裴海生等[53]考察了外源添加木质纤维素主要组分对灵芝菌体生长的影响,发现少量添加木质素对灵芝菌丝体生长有明显促进作用,木质素加量为1.0%时,灵芝菌丝体生长情况最好,生物量最多,同时灵芝胞外多糖、胞内多糖及灵芝胞内三萜、胞外三萜的合成均有明显提高。ZHANG J等[54]研究发现纤维素酶也是提高灵芝酸合成的有效诱导剂,在发酵的第3天向液体培养基中加入5 mg/L纤维素酶,可以使灵芝酸的最大产量达到1608mg/L。

4 结论与展望

灵芝中主要的活性成分灵芝多糖和灵芝酸是当代新药和保健食品开发的重要原料,然而由于灵芝子实体生长周期较长,且活性成分含量较低,故限制了该类成分的大规模研发和工业化生产。灵芝液体深层发酵技术的出现一定程度上解决了灵芝活性成分开发来源不足的问题,为了提高灵芝液体发酵合成活性代谢产物的效率,研究人员对培养基中外源诱导物的筛选、培养条件的优化及发酵工艺的改良等方面进行了大量的探索,其中,外源诱导因子的添加是解决灵芝活性代谢产物合成效率的关键问题。虽然一些诱导因子在工业生产中难以大量使用或对技术过程要求较高,但该类结果对于明确灵芝菌丝体生长、代谢以及活性成分合成的机理奠定了基础,为灵芝多糖和灵芝酸的进一步大规模生产加工提供了技术依据,促进了灵芝活性成分在医药食品等领域的产业化进程。

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ZHANG Ruiduo,LIU Huanhuan,GUO Feng,XIN Yu,QIU Zhidong,WANG Weinan*
(School of Pharmaceutical Sciences,Changchun University of Chinese Medicine,Changchun 130117,China)

TS262.6

0254-5071(2017)11-0015-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.11.004

2017-07-04

吉林省科技厅重大科技攻关项目(20160201001YY);吉林省教育厅重点项目(吉教科合字【2016】第26号)

张蕊多(1994-),女,硕士研究生,研究方向为中药化学成分生物转化研究。

*通讯作者:王伟楠(1985-),男,副教授,博士,研究方向为活性天然产物挖掘与生物转化研究。