高耐受性醋酸菌的研究和应用进展

张月阳,李海峰*,曹 健,2,徐孟孟

(1.河南工业大学 生物工程学院,河南 郑州 450001;2.中原工学院 材料与化工学院,河南 郑州 450007)

高耐受性醋酸菌的研究和应用进展

张月阳1,李海峰1*,曹 健1,2,徐孟孟1

(1.河南工业大学 生物工程学院,河南 郑州 450001;2.中原工学院 材料与化工学院,河南 郑州 450007)

酿醋工业的核心微生物是醋酸菌,其中最常用的菌种属于醋酸杆菌(Acetobacter)。研究表明,具有高耐受性的醋酸菌菌株在高浓度乙醇和高温条件下的产酸量仍可达到较高水平,对高耐受性醋酸菌菌株的发现为现代酿造工业带来了新的发展,有利于对不同生长与代谢特征醋酸菌菌种的挖掘以及新型酿造工艺的开发。该文综述了目前已知的高耐受性醋酸菌的特性及其在酿造工业生产中的应用进展,对更多高耐受性醋酸菌菌株的筛选以及酿造工艺的改进都具有重要的现实意义。

耐高温;耐高浓度乙醇;醋酸菌;酿造工业

醋酸菌(aceticacidbacteria,AAB)属于细菌域(Bacteria)、变形细菌门(Protebacteria)、α-变形菌纲(α-Protebacteria)、红螺菌目(Rhodospirillales)、醋酸菌科(Acetobacteracese)[1],能够氧化乙醇或糖类并生成乙酸或葡萄糖酸等有机酸,是一类重要的工业微生物,主要用于食醋与果醋饮料的生产[2]。醋酸菌不仅应用于生产葡萄糖酸、食醋和山梨酸等,还是乙醇和糖类氧化等生化反应中最重要的研究对象[3]。目前,醋酸菌在维生素C制造业、食醋酿造工业上都发挥着重要作用[4]。

在发酵生产乙酸的过程中,初始乙醇的含量和发酵温度是影响发酵的关键因素。乙醇是醋酸发酵的底物,并为醋酸菌的生长代谢提供能量,当乙醇含量超过4%vol时,醋酸菌的生长会受到抑制[5]。另一方面,温度是影响醋酸菌生长和代谢的重要因素,是醋酸菌氧化乙醇生成乙酸的必要条件。但是温度过高会使醋酸菌发酵的基本酶类变性,细胞膜受损伤,导致细胞分散[6]。因此,筛选出同时具有耐高浓度乙醇、耐高温和高产酸特性的醋酸菌则有利于醋酸菌发酵过程的优化,而其自身所具有的其他特异性功能也有巨大的研究与应用价值。

1 高耐受性醋酸菌特性

1.1 醋酸菌的生物学特性

醋酸菌属于革兰氏阴性严格需氧的细菌,目前已报道的醋酸菌共有16个属,其中最主要的是醋酸杆菌属(Acetobacter)、葡萄糖杆菌属(Gluconobacter)和葡萄糖醋酸杆菌属(Gluconacetobacter)。细胞形态有:椭圆、杆状、单生、成对或成链排列,细胞大小为(0.6～0.8)μm×(1.0～3.0)μm[7-8]。在有的种中退化型是非常常见的,呈现出球状的、丝状的、膨大的、成堆的、弯曲的、丝状的或者分枝的形态。细胞运动或不运动,运动型产周生鞭毛或极生鞭毛。一些菌株能产生色素或者纤维素,最适生长温度为28～36℃,最适pH值为5.4～6.3[9]。

1.2 高耐受性醋酸菌的发酵特性

1.2.1 高耐受性醋酸菌的耐高浓度乙醇能力

高耐受性醋酸菌一般都具有耐高浓度乙醇的能力。孙文瑛等[10]用溴甲酚绿平板法从腐烂水果中成功分离纯化出一株耐体积分数为11%的乙醇与38℃高温的醋酸菌,该菌种在经过优化培养之后,产酸量可达到48.6 g/L。侯小歌等[11]对宋河大曲中的醋酸菌进行分离鉴定时,发现其中醋酸杆菌属(Acetobacter)的氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)和醋化醋杆菌(Acetobacter aceti)在产酸过程中可耐受5%vol～11%vol的乙醇,其中氧化葡糖杆菌(Gluconobacteroxydans)的产酸性能受到含量为9%vol～11%vol乙醇的影响。另外吴晓英[12]也发现了巴氏醋杆菌(Acetobacter pasteurianus)的诱变菌种可以耐受11%vol的乙醇,而后发现该菌株在高浓度乙醇条件下,可以通过代谢合成细胞活性保护物质,如脯氨酸、亮氨酸和海藻糖等,从而维持细胞膜的流动性,为定向改造菌种提供了依据。陈洋等[13]在酿醋的醋醅中筛选出了耐受12%vol的乙醇与43℃高温的醋酸菌,并初步揭示了其耐受机理与乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase,ADH)和乙酸脱氢酶(aldehyde dehydrogenase,ALDH)的活性有密切关系。

1.2.2 高耐受性醋酸菌耐高温的能力

在对高耐受性醋酸菌的研究过程中发现,大多数的醋酸菌表现出良好的耐热性能。醋酸杆菌菌株(Acetobacter senegalensis)CWBI-B418r是从塞内加尔的芒果中分离出来的,这种新型菌株是严格的好氧菌,可在酵母葡萄糖矿物盐琼胶(yeast glucose mineral agar,YGM)培养基中35℃的条件下表现出最佳生长状态,并且在40℃时生长良好[14]。SOENPHOL W等[15]的研究表明,热带醋酸杆菌(Acetobacter tropicalis)SKU1100具有很好的耐热性能,甚至可以在40℃以上的条件下生长,还可以通过诱变获得产多糖的菌株,产生一种由半乳糖、葡萄糖和鼠李糖组成的薄皮多糖,并能够依附在细菌的表面上[16]。巴氏醋杆菌(Acetobacter pasteurianus)具有其特别的耐受性,不仅可以耐受体积分数12%的乙醇,并且可以耐受43℃的高温,这一研究结果对酿醋工业具有非常重要的影响[12-13]。

1.2.3 高耐受性醋酸菌的高产酸能力

在醋酸发酵过程中的产酸速率和产酸浓度是衡量醋酸菌菌种优劣的主要指标。优良的适合高浓度醋酸发酵的醋酸菌应该具备高效的氧化乙醇的酶系,对高浓度的醋酸具有良好的耐受性并且产酸速率快。张志燕等[17]从镇江香醋醋醅中分离得到了8株醋酸菌,对其分析结果表明,醋酸菌D-3-4的产酸量达到60 g/L,并且可耐受体积分数9%的乙醇以及42℃的高温,为优势高产酸菌株。姜晓芝等[18]从自制的果醋饮品中分离得到醋酸菌F9,经发酵测定其产酸量为56.3 g/L,可耐受体积分数11%的乙醇,并初步鉴定为醋化醋杆菌(Acetobacter aceti)。另外日本的正井博之成功地分离了在10%的酸度以上还能继续繁殖并产酸的醋酸菌(Acetobacter polyoxogenessp.nov),说明该醋酸菌在产酸过程中,酸度对其发酵的性能影响不大,还可以保持高产酸的能力[19]。王金丹等[20]发现了醋酸菌耐乙酸的机制与醋酸菌的ABC转运子、质子动力势外排泵、乙酸过氧化反应和基因与酶调控等有密切关系,为筛选高耐酸的醋酸菌种提供了依据。

1.2.4 高耐受性醋酸菌的发酵机制和产物

研究发现,高耐受性醋酸菌具有耐高温、耐高浓度乙醇以及高产酸及耐酸的能力与其自身独特的生理特性有关。高乙醇浓度下醋酸菌的乙醇脱氢酶(ADH)和乙酸脱氢酶(ALDH)仍然能够保持较高的活力从而保证了乙醇呼吸链的产能,并且能够有效地调节菌体内的碳代谢、脂代谢和氨基酸代谢,同时合成细胞活性保护物质,调节自身细胞膜脂肪酸组成并维持细胞膜一定的流动性[12]。另外,从酶学方面来讲,在发酵过程中ADH和ALDH的酶活力与醋酸菌的高耐受性也有很大关系。高乙醇浓度条件下,ALDH的酶活力明显会高于ADH,因此ADH成了高乙醇浓度条件下发酵过程中的限速酶。同时,高乙醇浓度条件下,酶活力越高,菌种所能转化的乙醇就会越多,菌种的生长越好,耐乙醇能力越强[13]。研究高温和乙酸对两种酶的影响,结果表明,菌种对高温的耐受性与它们的ADH和ALDH活力呈正相关;乙酸的存在对ADH和ALDH的酶活力具有较强的抑制作用。而耐高浓度乙醇的醋酸菌同时具有耐高温与耐酸的特性,这两种特性均有利于提升其对乙醇的耐受性[13]。

2 高耐受性醋酸菌的应用

2.1 高耐受性醋酸菌在酿醋工业中的应用

醋酸发酵过程是食醋酿造过程中最重要最关键的一个环节。通过对老陈醋不同发酵时间中醋醅产酸菌的变化趋势的综合分析,发现在发酵过程中最主要的菌种就是醋酸杆菌(Acetobactersenegalensis)和乳酸杆菌(Lactobacillus),这两种菌是酿醋工业中最主要的微生物[21]。而在食醋的酿造特别是深层发酵过程中,由于乙醇是醋酸发酵的底物,并会为醋酸菌的生长代谢等生命活动提供能量,因此乙醇的初始体积分数一般都会＞6%。而当乙醇的体积分数超过4%时,普通醋酸菌的生长就会受到一定的抑制[22]。乙醇会影响细胞膜的组织结构,改变其通透性,导致细胞生长缓慢产酸量降低[23]。此外,醋酸菌在发酵过程中会产生热量积累,随着发酵的进行,培养温度会逐渐升高从而超过醋酸菌的最适生长温度,温度过高就会使醋酸菌生长的酶系变性,导致细胞膜受损伤影响产酸[6]。在酿醋的深层发酵工艺中,初始乙醇体积分数较高,另外夏季高温时控制最适温度耗费的冷却成本太大,而利用高耐受性的醋酸菌菌株就可以改善上述问题。因此,高耐受性醋酸菌的耐高温以及耐乙醇的特性在酿醋工业中将会得到更广泛的应用,其潜在的价值也会得到深入的开发。

2.2 高耐受性醋酸菌在功能性饮料中的应用

近年来功能性饮料受到了越来越多消费者的青睐,主要是因为其具有多种基础氨基酸、有机酸等有益健康的成分,可以调节人体的酸碱平衡,具有提高免疫力等功能[24]。市场上的功能性饮料主要是通过多种菌种混合发酵而成。果醋就是其中的一种。果醋以水果或其浓缩的果汁(浆)等为主要原料,通过酵母菌和醋酸菌混合发酵而成[25]。果醋的制作一般都是利用微生物的二次发酵获得的,第一次为酵母菌发酵,将糖转化为乙醇,第二次为醋酸菌发酵,将乙醇转化为乙酸,再经过调配而成[26]。在制作果醋的过程中,醋酸菌的发酵过程受限于酵母菌的发酵,酵母菌转化乙醇的量过多就会抑制醋酸菌的发酵,致使醋酸菌的产酸量降低,从而影响得到的果醋的口感。因此高耐受性、高产酸量醋酸菌的应用就有利于解决果醋生产过程中醋酸菌生长受抑制的问题。

2.3 高耐受性醋酸菌在生物转化中的应用

生物转化是指利用全细胞或者提取的酶作为催化剂将底物转化为可利用的目标产物的过程[27]。基于高耐受性醋酸菌独特的代谢方式,使其在用于工业规模的生物转化中发挥重要作用。醋酸菌对于乙醇的氧化主要是醋酸菌中独特的氧化酶系,第一步是乙醇脱氢酶(ADH)将乙醇催化生成乙醛,第二步由乙醛脱氢酶(ALDH)将乙醛催化生成乙酸[28]。研究其中的重要氧化酶系对制醋工业的菌株选育有着重要的意义。另外在醋酸菌氧化乙醇的过程中会不断产酸,致使pH值不断降低,但是醋酸菌却仍然可以生长,这与其耐受性有很大关系。除了用于酿醋,醋酸菌还可以通过自身特殊的生物转化功能参与生产可可、纤维素等产品。在可可豆荚的发酵过程中随着乙醇体积分数的增加和温度的升高,酵母菌和乳酸菌的生长会受到抑制,这时由于高耐受性醋酸菌独特的代谢活动,其活性则不会受到太大影响,相反,充足的氧气和低的pH使其更加活跃。因此高耐受性醋酸菌也可以用于生物发酵过程的改进[29]。另外,醋酸菌也能够合成纤维素,其中木葡糖醋酸杆菌(Gluconacetobacter xylinus)是主要的功能菌,表现出对乙酸较高的耐受性(10%)[30],所合成的纤维素是目前已知的天然纤维中性能最好的纤维素,其纤维直径大概为10～100nm,但弹性指数却是普通纤维的几十倍[31]。随着生物转化研究工作的深入,对高耐受性高产酸醋酸菌的研究也越来越全面,生物转化的基础研究以及应用研究也会得到更快的发展,人们将会更多地受益于生物转化[32]。

3 结论与展望

高耐受性醋酸菌由于其具有耐高温、耐乙醇以及高产酸能力而被广泛应用于发酵食醋、功能性饮料果醋与生物转化等方面。醋酸菌的发酵过程主要依靠ADH、ALDH酶系的催化作用,而这两种酶的特性也影响着醋酸菌的产酸速率和耐受能力,并且可以通过诱变、筛选和基因工程等手段获得高耐受性高产酸的醋酸菌菌种。醋酸菌发酵过程中所产生的有机酸、氨基酸和活性多糖成分对人体的健康有着重要的保健和医疗作用,另外,高耐受性醋酸菌的潜在价值也需要研究学者们继续开发。

随着对高耐受性醋酸菌耐受机制的深入研究,以及基因转录和基因重组技术、16S～23S rDNA等醋酸菌的快速检测技术在醋酸菌选育上的应用[33],人们可以构建出耐更高温度、乙醇浓度以及高产酸量的醋酸工程菌株,而这也将大大提高我国对醋酸菌的利用率,降低工业生产的能耗,发展环保节能的醋酸菌利用产业。

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ZHANG Yueyang1,LI Haifeng1*,CAO Jian1,2,XU Mengmeng1
(1.College of Bioengineering,Henan University of Technology,Zhengzhou 450001,China;2.School of Materials and Chemical Engineering,Zhongyuan University of Technology,Zhengzhou 450007,China)

TQ939.99

0254-5071(2017)11-0011-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.11.003

2017-04-19

河南省教育厅科学技术研究重点项目(14A180021);省属高校基本科研业务费专项资金项目(No.2014YWQQ18)

张月阳(1993-),女,硕士研究生,研究方向为食品加工与安全。

*通讯作者:李海峰(1984-),女,副教授,博士,研究方向为食品微生物学。