番泻叶水提物对3T3-L1前脂肪细胞增殖、凋亡及脂联素基因表达的影响*

刘卫红，崔 琳，路玲玲，李 强

番泻叶水提物对3T3-L1前脂肪细胞增殖、凋亡及脂联素基因表达的影响*

刘卫红1)△，崔 琳1)，路玲玲2)，李 强3)

番泻叶水提物；3T3-L1前脂肪细胞；荧光素酶

目的：观察番泻叶水提物(FSAE)对3T3-L1前脂肪细胞增殖及凋亡影响，并进一步研究FSAE对3T3-L1前脂肪细胞脂联素mRNA及脂联素启动子荧光素酶活性的影响。方法体外培养3T3-L1前脂肪细胞，给予不同质量浓度FSAE刺激24 h，MTT法检测细胞增殖，AnnexinV-FITC/PI双染法检测细胞凋亡，Western blot法检测细胞凋亡蛋白Caspase-3、Bax的表达，荧光定量PCR、双荧光素酶报告基因法检测FSAE对3T3-L1脂肪细胞脂联素mRNA和脂联素基因启动子活性的影响。结果不同质量浓度FSAE对3T3-L1前脂肪细胞的增殖有抑制作用，能够促进细胞凋亡，提高凋亡蛋白Caspase-3、Bax蛋白的表达；同时，FSAE能够增加3T3-L1前脂肪细胞中脂联素mRNA的表达，提高其启动子活性。结论上述研究结果可能为FSAE抑制肥胖提供分子生物学依据。

肥胖在全球范围内流行，而它发生的病理生理学核心是脂肪细胞的增殖与分化。脂肪细胞可以产生多种具有生物活性的脂肪细胞分泌因子(adipokines，ADS)。ADS的表达异常与肥胖相关的胰岛素抵抗、2型糖尿病及心血管疾病(cardiovascular disease，CVD)的发生密切相关[1]。因此，以脂肪细胞及其分泌的细胞因子为对象进行肥胖机制的研究成为热点。中药治疗肥胖历史悠久，已成为减肥药物研发的宝贵资源。番泻叶为豆科植物狭叶番泻或尖叶番泻的小叶，属于天然药物；现代药理研究表明番泻叶中含蒽醌衍生物，其泻下作用及刺激较含蒽醌类的其他泻药更强[2-3]。作者选取番泻叶水提物(FoliumSennaeaqueous extracts，FSAE)作为研究对象，拟观察其对3T3-L1前脂肪细胞增殖、凋亡、脂联素mRNA及其基因启动子活性的影响，从分子生物学方面探讨番泻叶可能具有的降脂作用。

1 材料与方法

1.1主要材料番泻叶药材购自河南中医药大学第一附属医院药房，提取方法参照文献[4]并有所改进。取药材50 g，加入8倍量水，加热回流提取2次(回流1.5 h/次),将所得药液纱布过滤，离心后浓缩至100 mL,得 500 g/L的水提液，再次纱布过滤，灌装密封，高压灭菌，4 ℃保存备用。3T3-L1前脂肪细胞购自中科院上海细胞所，高糖DMEM培养基、新生牛血清(美国Gibco公司)，胰蛋白酶、MTT(北京Solarbio公司)，pGL3-Basic质粒、pRL-TK内参质粒、双荧光素酶检测试剂盒(美国Promega公司)，Lipofectamine2000试剂盒(美国Invitrogen公司)，细胞凋亡检测试剂盒(美国BD公司)，Caspase-3、Bax一抗(Abcam公司)，二抗(Santa Cruz公司)，荧光定量PCR仪(美国Applied Biosystems公司)，CK40倒置显微镜(日本Olympus公司)，CO2细胞培养箱(美国Thermo公司)，高速低温离心机(德国heraus公司)，多功能酶标仪(美国MD公司)。

1.2FSAE对3T3-L1前脂肪细胞增殖的影响3T3-L1前脂肪细胞在含有100 IU/L青霉素和100 mg/L链霉素、体积分数10%新生牛血清的DMEM培养基中培养，细胞生长至90%融合后传代。取对数生长期细胞，以1×105mL-1的密度接种于96孔板，每孔100 μL，培养24 h待细胞贴壁后，更换无血清培养基。细胞分为正常组及不同剂量FSAE组。正常组加入普通培养基，FSAE低、中、高剂量组分别加入0.01、0.10和1.00 g/L的FSAE，每组均设6个复孔。均继续培养24 h，倒置显微镜下观察记录细胞形态学变化。之后更换无血清培养基，每孔加入5 g/L MTT 10 μL，继续培养4 h，弃MTT，加入DMSO溶解沉淀，酶标仪测定490 nm处的吸光度值(A)。

1.3FSAE对3T3-L1前脂肪细胞凋亡的影响采用流式细胞仪按照BD公司的细胞凋亡检测试剂盒说明书进行检测。细胞按照1×105个/孔密度接种于6孔板，培养24 h待细胞贴壁后，更换无血清培养基，分组同1.2。继续培养24 h收获细胞，冷磷酸盐缓冲液洗2次，取悬液100 μL，分别添加异硫氰酸荧光素标记膜联蛋白和碘化丙啶各5 μL，室温避光20 min，再添加400 μL 1×缓冲液，室温避光染色30 min后上机检测。1 h内上机检测正常、凋亡和坏死的细胞，由FLOJO软件分析凋亡率。每组6个复孔。

1.4促凋亡蛋白Caspase-3和Bax表达的Westernblot检测将3T3-L1前脂肪细胞以2×105mL-1的密度接种于6孔板，每孔1 000 μL，细胞分组同1.2。继续培养24 h收获细胞，细胞裂解液裂解，4 ℃ 12 000 r/min离心15 min 提取蛋白。100 g/L SDS-PAGE电泳并转至PVDF膜上。50 g/L脱脂奶粉室温封闭1 h，加Caspase-3和Bax单克隆抗体4 ℃过夜，TBST洗脱。加辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗37 ℃孵育1 h，TBST洗脱。ECL发光试剂显影，暗室曝光。以GAPDH作为内部对照，采用Image ProPlus图像分析软件分析各蛋白条带的积分光密度值，以目的条带与GAPDH条带积分光密度值的比值表示目的蛋白相对表达量

1.5FSAE对3T3-L1前脂肪细胞脂联素启动子荧光素酶活性的影响将3T3-L1前脂肪细胞以1×105mL-1密度接种于24孔板中，每孔500 μL。细胞生长达到融合后更换Opti-MEM培养基，正常对照组只加pGL3-Basic空白质粒；低、中、高剂量FSAE组先加入0.01、0.10、1.00 g/L FSAE培养24 h，然后加入重组质粒pGL3-Basic-ADI1100[5-9]。培养2 h更换普通培养基培养液，收集处理48 h后的样品进行荧光素酶活性检测。

1.6FSAE对3T3-L1前脂肪细胞脂联素mRNA表达的影响将3T3-L1前脂肪细胞以2×105mL-1的密度接种于6孔板，每孔1 000 μL，细胞生长达到融合后分为正常组及低、中、高剂量FSAE组，继续培养24 h后收集细胞悬液，置于灭活RNA酶的EP管内，Trizol试剂提取RNA，根据反转录试剂盒说明操作反转录成cDNA，然后用荧光定量PCR仪进行扩增，以ACTIN为内部对照，采用2-ΔΔCt相对定量法计算脂联素mRNA的相对表达量。ACTIN上游引物序列：5’-CACACCCGCCACCAGTTCGC-3’，下游引物序列：5’-TTGCACATGCCGGAGCCGTT-3’；脂联素上游引物序列：5’-GGGTCTGCCTGTCCCCATGAGT-3’，下游基因引物序列：5’-CCTGAGCCCTTTTGGT GTCGTC-3’。

1.7统计学处理采用SPSS 17.0进行分析，应用单因素方差分析和LSD-t检验比较不同剂量FSAE对3T3-L1前脂肪细胞增殖、凋亡、Caspase-3和Bax蛋白表达及脂联素mRNA表达的影响。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1FSAE对3T3-L1前脂肪细胞形态及细胞增殖、凋亡的影响见图1、表1。如图1所示，正常组细胞生长旺盛，伸展性良好。FSAE低、中、高剂量组刺激24 h后出现间隙变宽和形变，呈较为明显的剂量-效应关系。FSAE中、高剂量组A值低于正常组，差异有统计学意义(P<0.05)。FSAE低、中、高剂量组细胞凋亡率较正常组上升(P<0.05)。

A：正常组，B～D:低、中、高剂量FSAE组。图1 3T3-L1前脂肪细胞的形态变化

2.2FSAE对3T3-L1前脂肪细胞Caspase-3、Bax蛋白表达和脂联素启动子活性及mRNA表达的影响见图2、表2。

表1 FSAE对3T3-L1前脂肪细胞增殖、凋亡的影响(n=6)

*：与正常组相比，P<0.05；#：与低、高剂量组相比，P<0.05。

1：正常组；2:FSAE低剂量组；3:FSAE中剂量组；4:FSAE高剂量组。图2 各组细胞中Caspase-3和Bax 蛋白的表达

组别Caspase⁃3蛋白Bax蛋白脂联素启动子活性比值脂联素mRNA相对表达量正常组0．853±0．0260．680±0．0070．781±0．0051．000±0．067FSAE组低剂量组1．282±0．0591．076±0．0420．842±0．010∗1．620±0．019∗FSAE组中剂量组1．536±0．035∗#1．456±0．425∗#0．731±0．009∗#2．422±0．013∗#FSAE组高剂量组1．903±0．014∗1．747±0．037∗0．620±0．018∗1．718±0．066∗F417．259517．316525．686549．497P<0．001<0．001<0．001<0．001

*：与正常组相比，P<0.05；#：与低、高剂量组相比，P<0.05。

3 讨论

脂肪细胞数量的增加和体积的增大是肥胖的两大表现。凋亡在病理及生理过程中都发挥重要的作用[10-12]。研究[13-15]表明，脂肪细胞数量受细胞增殖与凋亡双重调控。许多天然的植物能抑制小鼠前脂肪细胞增殖活性并诱导其启动凋亡途径，因此具有降低体重的潜力。脂肪细胞不仅是能量储存器官，还是一种内分泌组织，可分泌多种细胞因子和炎性蛋白；脂联素是由脂肪细胞分泌的细胞因子，在肥胖时水平降低[16-17]。 本实验形态学显示，正常3T3-L1前脂肪细胞生长状态旺盛，伸展性良好，呈铺路石样生长。不同剂量FSAE作用24 h 后，3T3-L1前脂肪细胞出现细胞间隙变宽，脱落细胞增多，呈较为明显的剂量-效应关系。MTT法和流式细胞仪检测结果显示，FSAE作用3T3-L1前脂肪细胞24 h，能够抑制细胞的增殖、增加细胞凋亡，且呈现剂量-效应关系。

荧光定量PCR结果显示，不同剂量FSAE作用于细胞24 h,能够增加脂联素mRNA的表达。为了进一步验证番泻叶分子生物学作用是否通过干预脂肪细胞因子的转录调节过程，本实验将脂联素基因启动子片断的质粒转染细胞，观察番泻叶处理对荧光素酶报告基因表达的影响。通过启动子活性分析，发现与启动子区相应DNA片段作用后，启动子活性受到显著抑制，提示脂联素启动子活性升高可能是番泻叶诱发的脂联素表达增高的原因之一。

总之，番泻叶对3T3-L1前脂肪细胞增殖具有抑制作用；提高细胞凋亡率，促进凋亡蛋白表达，提高脂联素mRNA表达；番泻叶还可能通过提高脂联素基因启动子活性而促进脂联素表达，这些都为从分子生物学方面阐述番泻叶可能具有的降脂作用提供了理论依据。

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(2017-01-18收稿 责任编辑赵秋民)

Effect ofFoliumSennaeaqueous extracts on 3T3-L1 cell apoptosis and expression of adipokines

LIUWeihong1),CUILin1),LULingling2),LIQiang3)

1)CentralLaboratory,theFirstAffiliatedHospital，HenanUniversityofTraditionalChineseMedicine,Zhengzhou450000 2)PuyangHospitalofTraditionalChineseMedicine,Puyang,Henan457001 3)HenanKeyLaboratoryofTraditionalChineseMedicineControlforViralDiseases,Zhengzhou450000

FoliumSennaeaqueous extract;3T3-L1 cell;luciferase activity

Aim: To determine the effect ofFoliumSennaeaqueous extract(FSAE) on 3T3-L1 cell proliferation and apoptosis, and further study its effect on 3T3-L1 adiponectin mRNA and adiponectin promoter luciferase activity.Methods3T3-L1 cells were incubated with different concentrations of FSAE for 24 h, and cell proliferation was determined by MTT method;AnnexinV-FITC/PI double staining was used to detect cells apoptosis;Western blot was used to detect the expressions of Caspase-3 and Bax protein;Fluorescence quantitative PCR was used to detect adiponectin mRNA expression; double fluorescein enzyme report gene method was used to detect the influence of adiponectin gene promoter activity.ResultsDifferent concentration FSAE inhibited 3T3-L1 proliferation,promoted cell apoptosis, improved the expressions of apoptosis related protein Caspase-3 and Bax;At the same time, FSAE improved adiponectin mRNA expression, and enhanced its adiponectin promoter activity.ConclusionThis may provide a molecular basis for FASE inhibiting obesity.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.06.021

*河南省教育厅自然科学研究资助计划项目 2010B360009；郑州市科技攻关计划项目 0910SGYS33391-1

1)河南中医药大学第一附属医院中心实验室 郑州 450000 2)濮阳市中医院康复科 河南濮阳 457001 3)河南省病毒性疾病中医药防治重点实验室 郑州 450000

△女，1970年10月生，硕士，副主任药师，研究方向：中药药理学，E-mail:lwh_c@163.com

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