HPLC法测定贵州不同地区番石榴叶中两种黄酮苷的含量
2017-11-30
1.贵州省安顺市食品药品检验所,贵州 安顺 561000;2.贵州省安顺市中医院,贵州 安顺 561000;3.贵州省安顺市人民医院,贵州 安顺561000;4.贵阳中医学院,贵州 贵阳 550025;5.中央民族大学,北京 100081
HPLC法测定贵州不同地区番石榴叶中两种黄酮苷的含量
李开斌1孙刚1郑宗华2杨文1宴晨3马四补4,5*
1.贵州省安顺市食品药品检验所,贵州 安顺 561000;2.贵州省安顺市中医院,贵州 安顺 561000;3.贵州省安顺市人民医院,贵州 安顺561000;4.贵阳中医学院,贵州 贵阳 550025;5.中央民族大学,北京 100081
目的对贵州不同地区番石榴叶药材中金丝桃苷和异槲皮苷变化进行研究,探讨番石榴叶药材有效成分与产地相关性变化,为番石榴叶药材生产和质量保障提供数据支撑。方法采用高效液相色谱法,色谱柱Agilent XDB-C18柱(4.6mm×250mm,5μm);流动相为乙腈-0.1%甲酸(13∶87),柱温为25℃,检测波长为257nm;流速1.0mL/min,测定贵州不同地区番石榴叶药材中金丝桃苷和异槲皮苷含量。结果通过方法学考察,HPLC检测番石榴叶中两种黄酮苷含量,实验准确可靠,方法简便易行;在同一时段内,不同产地番石榴叶中两种黄酮苷变化较大,不同产地药材质量差异明显。结论建立了番石榴叶药材两种黄酮苷的检测方法,方法准确可靠、简便易行;贵州不同区域产番石榴叶药材中两种黄酮苷的含量差异明显,靠近河谷的罗甸沟亭乡所产番石榴叶药材品质较好。
番石榴叶;金丝桃苷;异槲皮苷
番石榴(PsidiumguajavaL.)为桃金娘科番石榴属植物,为常绿多年生灌木或小乔木[1],在我国的广西、广东、海南等均有人工栽培[1],贵州民间多有习用,番石榴叶别名“鸡矢茶”、“番桃叶”、“番石榴心”、“麻里杆”等,是番石榴的干燥叶及带叶嫩茎。在贵州多为野生品种。本品质脆易碎,气微,揉之有香气,味涩,微苦,性平。具有健胃消食、涩肠止泻、收敛止血、抗氧化的作用。主要含黄酮类、挥发油、鞣质、植物固醇、多糖等化学成分[2]。结合贵州民间用药习惯,研究选择与疗效相关的两种黄酮苷作为控制指标对贵州不同区域的番石榴叶药材含量相关性进行探索,测定了采收时间和方式相同条件下的不同地区番石榴叶药材两种黄酮苷的变化趋势,建立了准确可靠、简便易行的检测方法,为番石榴叶药材质量控制和药材生产提供科学的数据支撑。
1 仪器与材料
1.1 仪器 Agilent 1260高效液相色谱仪(安捷伦液相色谱工作站,美国安捷伦公司);TU-1901型双光束紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司);AY-120型岛津托盘电子天平;KQ3200DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。
1.2 试剂 乙腈为色谱纯,甲醇、甲酸、乙醇均为分析纯,水为超纯水。金丝桃苷对照品由中国药品生物制品检定所提供,批号:111521-201507,含量94.3%,异槲皮苷对照品由中国药品生物制品检定所提供,批号:111809-201403,含量92.9%。
1.3 样品 样品采自贵州省黔西南州安龙县坡脚乡坡脚村、望谟蔗香镇移民村、望谟桑朗镇、册亨县巧马镇、黔南州罗甸沟亭乡,均由贵阳中医学院药学院生药教研室魏升华教授鉴定为番石榴(PsidiumguajavaL.)的干燥叶。
2 方法与结果
2.1 色谱条件 色谱柱:Agilent XDB-C18柱(4.6×250mm,5μm);流动相:乙腈-0.1%甲酸水溶液(13∶87);柱温:25 ℃;检测波长:257 nm;流速1.0 mL/min;进样体积:10 μL。
2.2 对照品溶液的制备 分别精密称取金丝桃苷对照品10.61 mg和异槲皮苷对照品10.78 mg,分别置100 mL量瓶中,加60 %甲醇溶解并稀释至刻度,作为对照品贮备液。分别精密量取对照品贮备液各3 mL于同一25 mL容量瓶中,加60 %甲醇溶液稀释至刻度,制成每1 mL含金丝桃苷、异槲皮苷分别为12.01 ug、12.02 ug的混合对照品溶液即得。
2.3 供试品的制备 取番石榴叶粉末(过四号筛)约0.2 g,精密称定,置25 mL容量瓶中,加入60%甲醇20 mL,超声提取(功率500 W,频率40 kHz)40 min,取出放冷,用60%甲醇稀释至刻度,摇匀,用0.45 μm微孔滤膜滤过,取续滤液即得。
2.4 系统适用性试验 分别取金丝桃苷,异槲皮苷对照品溶液、供试品溶液以及甲醇溶液注入液相色谱仪,记录色谱图。从图中可见空白无干扰,对照品与供试品图谱金丝桃苷,异槲皮苷的保留时间一致,金丝桃苷,异槲皮苷与其相近的峰分离完全(分离度gt;1.5)。对照品色谱中金丝桃苷,异槲皮苷峰的理论塔板数分别为8261和8644,供试品溶液的色谱中金丝桃苷,异槲皮苷峰的理论塔板数分别为7503和4131,即理论板数以异槲皮苷计算应不低于2000。结果如图1、图2所示。
2.5 线性关系考察 精密量取“2.2”项下的对照品贮备液各3 mL于同一10 mL容量瓶中,加60%甲醇稀释至刻度,精密吸取该混合对照品溶液1、3、5、10、20、40 μL,注入液相色谱仪,记录色谱图,以峰面积A对质量数X(μg)进行线性回归计算,得线性回归方程为:金丝桃苷:A=28.245X-13.341(R2=0.9999)异槲皮苷:A=27.243X+31.685(R2=0.9998),结果表明金丝桃苷在3.0016~120.0627μg,异槲皮苷在3.0044~120.1754μg范围内与峰面积呈现良好的线性关系。
将“2.2”项下的混合对照品溶液(浓度分别为0.01201 mg/mL,0.01202 mg/mL)所测得的金丝桃苷峰面积322.453代入上述线性回归方程得C=0.01189 mg/mL,与0.01201 mg/mL相比,相对标准偏差(RSD)为0.92%;再将异槲皮苷峰面积363.122代入回归方程得C=0.01217 mg/mL,与0.01202 mg/mL相比,相对标准偏差(RSD)为0.88%,均较小。所以该浓度的混合对照品在此线性范围内呈良好的线性关系。
2.6 仪器精密度、稳定性、重复性考察 取同一对照品连续进样6次,计算金丝桃苷和异槲皮苷峰面积的RSD值,分别为0.74%,0.65%;取同一对照品和同一样品分别于0、4、8、12、16、24 h进样测定金丝桃苷与异槲皮苷峰面积,对照品RSD值为0.44%和0.54%,样品RSD值为0.72%和0.96%,说明对照品和样品在24 h稳定性均较好;取同一批次样品6份,平行制备6份供试品溶液,测定金丝桃苷与异槲皮苷的含量,所得含量RSD值为1.8%和1.1%,说明该方法重复性强。
2.7 加样回收率试验 取贵州黔西南安龙县坡脚乡坡脚村样品(粉碎,过4号筛)6份,每份约0.1 g,精密称定,置25 mL容量瓶中,加入金丝桃苷与异槲皮苷(浓度分别为0.006003 mg/mL,0.008012 mg/mL)的混合对照品溶液20mL,按2.3项下方法制备供试品溶液,测定含量,计算金丝桃苷与异槲皮苷的平均回收率分别为96.16%,100.03%,RSD分别为 1.2%,0.4%,表明该方法测定准确度较高。结果见表1。
表1 番石榴叶中金丝桃苷与异槲皮苷的加样回收试验结果
2.8 样品测定 取贵州南盘江流域内不同地区的番石榴叶药材粉末,照“2.3”项下方法提取供试品溶液,测定含量,按干燥品计算药材中金丝桃苷与异槲皮苷的总量。结果见表2。
表2 不同产地番石榴叶药材中金丝桃苷与异槲皮苷含量测定结果
3 讨论
实验采用HPLC法同时测定了番石榴叶药材中两种黄酮苷类成分,待测组分互不干扰,控制指标成分法定可得,两种黄酮苷结构相似,其中金丝挑苷具有较好活性。通过检测两种槲皮素苷对番石榴药材质量进行评价,较单一用槲皮素评价药材有很强的优势。槲皮素作为质量控制指标之一涉及水解过程,在药典和报道中多采用酸水解,提取条件控制较苛刻,操作要求较高,而黄酮苷作为指标控制成分,实验操作性强,简便却准确可靠。多组分活性物质作为药材质量控制指标,可以更全面地评价药材的质量,由于番石榴叶药材特异性和检测可追溯性,选择金丝桃苷与异槲皮苷的总量作为番石榴叶药材控制方式较为合适。
由表2可知贵州省不同产地的番石榴叶药材中金丝桃苷与异槲皮苷的含量差异较大,金丝桃苷在1.0~3.8 mg/g,异槲皮苷在1.7~2.7 mg/g,金丝桃苷波动较大,而异槲皮苷的波动较平稳,两者的总量波动也较大,且有伴随纬度降低而升高的一致性。通过对贵州省番石榴叶不同地区药材质量的对比研究,结合民族用药与中药质量控制特点[7],以看出该药材随地域环境不同的质量变化趋势,为更好应用和开发贵州民族医药提供实验数据支撑。
[1]钟思强,黄树长.番石榴的营养价值及其高效栽培技术[J].中国南方果树,2008,37(1):41-43.
[2]欧阳文,朱晓艾,邵祥辉,等.番石榴叶乙酸醋萃取化学成分研究[J].食品科学,2014,35(15):30-37.
[3]Gutié rrez R M P,Mitchell S,Solis R V.Psidium guajava:A review of its traditional uses,phytochemistry and pharmacology[J].Journal of Ethnopharmacology,2008,117(1):1-27.
[4]Makino T,KanemaruM,Okuyama S,et al.Anti-allergic effects of enzymatically modified isoquercitrin(alpha-oligoglucosyl quercetin3-O-glucoside),quercetin3-O-glucoside,alpha-oligoglucosyl rutin,and quercetin,when administered orally to mice[J]. Nat Med,2013,67(4):881-886.
[5]黄凯,杨新波,黄正明.金丝桃苷药理作用研究进展[J].医药导报,2009,28(8):1046-1048.
[6]林萍,易宏伟,张裴.金丝挑着药理作用研究进展[J].中国现代中药,2012,14(10):23-26.
[7]李志勇,李彦文,朴香兰,等.论中药与民族药的关系[J].贵阳中医学院学报,2012,34(1):26-28.
李开斌(1979-),男,汉族,本科,主管中药师。研究方向为药材质量控制与检验检测。E-mail:826735176@qq.com
马四补(1979-),男,回族,博士研究生在读,副教授。研究方向为中药、民族药物质基础研究。E-mail:453175568@qq.com
R284.1
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1007-8517(2017)21-0019-03
2017-09-13 编辑:邓佳丽)