高原低氧环境下小鼠皮层神经元自噬与凋亡的相关性研究

马文科 戴舒惠 杨悦凡 罗鹏 费舟

(第四军医大学西京医院神经外科，陕西 西安 710032)

·论著·

高原低氧环境下小鼠皮层神经元自噬与凋亡的相关性研究

马文科 戴舒惠 杨悦凡 罗鹏 费舟*

(第四军医大学西京医院神经外科，陕西 西安 710032)

目的观察6000 m海拔高度下不同时长的高原低氧暴露对小鼠皮层神经元自噬及凋亡的影响，探讨其相关性。方法40只C57BL/6小鼠随机分为平原对照组及不同时长(1 d、3 d、7 d、14 d)的高原低氧处理组，每组8只。模拟6000 m海拔的高原低氧环境，实验组分别给予1 d、3 d、7 d、14 d的高原低氧处理，对照组饲养于舱外。采用Western Blot检测低氧诱导因子-1α(HIF-1α)及自噬标志物Beclin-1、微管相关蛋白1轻链3-II(LC3-II)在皮层组织的表达；赫斯特荧光染料33342(Hoechst 33342)染色用于观察皮层神经元的凋亡改变。结果与平原对照组相比，不同时长的高原低氧处理增加了小鼠皮层组织HIF-1α、Beclin-1及LC3-II的表达，同时明显增加了皮层神经元的凋亡率。结论高原低氧环境下，自噬的激活可能是小鼠皮层神经元凋亡发生的重要原因，而HIF-1α在该过程中可能发挥了重要的调控作用。

高原低氧; 神经元; 自噬; 凋亡

中枢神经系统耗氧量大、低氧耐受性差，在高原低氧环境下会首先出现不同程度的缺氧性损害，表现出高原性头痛(high-altitude headache, HAH)、急性高山病(acute mountain sickness, AMS)和高原性脑水肿(high-altitude cerebral edema, HACE)等神经系统症状。研究显示高原低氧环境下神经元会发生凋亡、变性等损伤，提示高原性脑损害与神经元的损伤密切相关[1]。自噬是应激条件下细胞利用溶酶体降解并重复利用自身细胞器、蛋白或清除损伤的细胞器及蛋白的代谢过程[2,3]。根据底物进入溶酶体的途径，自噬可以分为微自噬(microautophagy)、巨自噬(macroautophagy)及分子伴侣介导的自噬(chaperone-mediated autophagy)。有大量文献报道，自噬(本文提到的自噬特指巨自噬)的激活可以减轻缺血缺氧导致的神经元损伤，从而发挥神经保护作用[4-5]。但是，在高原低氧环境下，自噬在神经元转归中发挥的作用以及与高原低氧暴露时间之间的关系目前仍不清楚。

本研究利用低压氧舱，模拟了6000 m海拔的高原低氧环境，旨在观察不同时长的高原低氧暴露对小鼠皮层组织低氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α)及自噬标志物Beclin-1、微管相关蛋白1轻链3-II(microtubule-associated protein 1 light chain 3- II, LC3-II)表达的影响，以及对皮层神经元凋亡的影响，进而了解高原低氧环境下自噬与凋亡之间的可能关系和相关调节机制，为高原性脑损害分子病理机制的深入研究奠定基础。

材料与方法

一、实验动物及分组

健康雄性C57BL/6小鼠40只，购自第四军医大学实验动物中心，体重18～20 g。小鼠统一编号后，采用SPSS 19.0软件产生的完全随机数字分为平原对照组、高原低氧处理1 d、3 d、7 d及14 d组，每组8只。

二、实验试剂与仪器

细胞裂解液购于北京鼎国昌盛；二喹啉甲酸(bicichoninic acid, BCA)蛋白定量试剂盒购于北京博奥森；凝胶电泳试剂盒购于上海碧云天；化学发光底物购于美国Advansta公司；小鼠抗HIF-1α、兔抗LC3购于Sigma公司；兔抗Beclin-1、兔抗β-actin购于美国Cell Signaling Technology公司；辣根过氧化物酶标记的抗兔、抗鼠IgG购于北京康为世纪；Hoechst 33342染色液购于万类生物科技；低压氧舱由第四军医大学预防系提供。

三、建立高原低氧模型

本研究利用低压氧舱模拟了6000 m海拔的高原环境，建立了高原低氧模型。6000 m海拔下低压氧舱的相关参数：舱内压力47.2 kPa，舱内温度25.6 ℃，舱内湿度为21.3%，12 h明暗交替光照，运行时间24 h/d，降舱速度为5 m/s。实验期间小鼠自由摄食水。各实验组小鼠置于低压氧舱后给予相应时长的高原低氧处理；对照组小鼠不作处理，置于舱外饲养(西安海拔约为400 m)。

四、组织样本制备

各组小鼠出舱后，随机选取4只，腹腔麻醉后开胸，经左心室用4%甲醛充分灌注固定，开颅取脑后继续用4%甲醛固定1 w。常规脱水、浸蜡、包埋，选取皮层组织连续切片，用于Hoechst 33342染色。各组剩余小鼠断头处死，冰上迅速分离皮层组织，-80 ℃保存，用于后续Western Blot实验。

五、Western Blot法检测蛋白表达

根据皮层组织块大小加入适当体积的细胞裂解液及蛋白酶抑制剂，冰上充分研磨裂解后12 000 r/min离心40 min，取上清进行蛋白定量检测，并制备成Western Blot蛋白样品。常规电泳，转膜90 min，小鼠抗HIF-1α一抗(1∶4000)、兔抗Beclin-1一抗(1∶2000)、兔抗LC3一抗(1∶2000)、兔抗β-actin一抗(1∶5000)，山羊抗小鼠、抗兔二抗(1∶20 000)，化学发光后用扫描仪采集电子图像信息，测量灰度值进行统计学分析。

六、Hoechst 33342染色

切片常规脱蜡至水，磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution, PBS)洗涤后，Hoechst 33342常温避光染色7 min，PBS洗涤，甘油封片。荧光显微镜下观察皮层神经元细胞核形态学及染色改变，致密浓染或碎块状致密浓染的神经元为Hoechst阳性细胞，即凋亡细胞。高倍镜下随机选择5个不同视野计数凋亡细胞相对数目，进行统计学分析。

七、统计分析

结 果

一、高原低氧环境对小鼠皮层组织自噬标志物表达的影响

Western Blot结果显示，与平原对照组相比，不同时长(1 d、3 d、7 d、14 d)的高原低氧处理均明显上调了小鼠皮层组织Beclin-1的表达，差异有统计学意义(图1A)。同时，LC3-II也在不同时长的高原低氧处理后表达明显增高，差异具有统计学意义(图1B)。

二、高原低氧环境对小鼠皮层组织HIF-1α表达的影响

Western Blot结果显示，与平原对照组相比，小鼠皮层组织HIF-1α在高原低氧暴露1 d、3 d、7 d、14 d后表达均明显增高，差异有统计学意义(图2)。HIF-1α在高原低氧暴露1 d后表达即达到高峰，后呈持续性高表达。

图1 高原低氧环境上调了小鼠皮层组织Beclin-1和LC3-II表达
Fig 1 High-altitude hypoxia exposure for different duration (1 d, 3 d, 7 d and 14 d) up-regulated the expression of Bcelin-1 and LC3-II in mouse cortex
A: Quantity of Bcelin-1 was detected by Western Blot (aPlt;0.01,bPlt;0.001,vscontrol group); B: Quantity of LC3-II was detected by Western Blot (aPlt;0.05,bPlt;0.01,vscontrol group).

Note: HH stands for high-altitude hypoxia exposure, and the number behind HH stands for high-altitude hypoxia exposure time.

图2 高原低氧环境上调了小鼠皮层组织HIF-1α的表达
Fig 2 High-altitude hypoxia exposure up-regulated the expression of HIF-1α in mouse cortex
A: Western Bot analysis of HIF-1α after high-altitude hypoxia exposure for 1 d, 3 d, 7 d and 14 d; B: Quantification of band densities showed that high-altitude hypoxia exposure for different duration (1 d, 3 d, 7 d, and 14 d) was significantly increased the expression of HIF-1α.

aPlt;0.05,vscontrol group.

图3 高原低氧暴露增加了小鼠皮层神经元的凋亡率(Hoechst, ×200)
Fig 3 High-altitude hypoxia exposure increased neuronal apoptosis rates in mouse cortex (Hoechst, ×200)

A～E: Hoechst 33342 staining results after high-altitude hypoxia exposure for 1 d, 3 d, 7 d and 14 d in mouse cortex; F: Neuronal apoptosis rates was significantly increased after high-altitude hypoxia exposure.

aPlt;0.001,vscontrol group.

Bar=50 μm.

三、高原低氧环境对小鼠皮层神经元凋亡的影响

Hoechst 33342染色显示，对照组小鼠皮层神经元细胞核形态及染色基本正常，而不同时长的高原低氧处理组Hoechst阳性的神经元，即凋亡的神经元明显增多(图3A～E)。统计分析显示，不同时长的高原低氧处理后小鼠皮层神经元的凋亡率均明显增加，差异有统计学意义(图3F)。

讨 论

高原环境空气稀薄、氧分压低。进入高原地区时，人体首先可以通过加快呼吸、心率等方式代偿大气环境低氧造成的组织供氧不足。然而，当代偿机制仍无法满足机体氧需求时，由于脑组织对氧极为敏感，便会出现高原性脑损害。

高原低氧环境下脑损害发生的相关机制有[6]：ATP合成减少导致钠钾ATP酶活性降低，从而使细胞内水钠潴留，引起脑细胞水肿；自由基的过度释放及血管内皮生长因子的表达增多破坏了血管基膜的完整性，导致血管通透性增加，加重了脑水肿；血管内皮细胞NO释放的增加导致其对Ca2+的敏感性下降，从而使脑血管舒张、灌注压升高。也有研究显示高原低氧环境下神经元会出现凋亡、变性等损伤[1,7]，提示高原低氧环境下神经元的损伤是高原性脑损害发生的重要因素，但具体的损伤机制目前仍不清楚。此外，有大量研究发现，自噬在缺血缺氧条件下发挥了神经保护作用，提示自噬可能是影响低氧条件下神经元转归的重要因素[4-5]。然而，在高原低氧这种特殊环境下，自噬的激活与神经元的转归是否相关，目前仍无文献报道。

本研究利用低压氧舱模拟了6000 m海拔的高原低氧环境，初步阐明了不同时长的高原低氧暴露对小鼠皮层神经元自噬的影响，证实了高原低氧环境下小鼠皮层神经元凋亡的发生，探讨了该环境下自噬在神经元凋亡中的可能作用及相关调节机制。

首先，我们通过Western Blot实验观察了不同时长的高原低氧处理对皮层神经元自噬的影响。Beclin-1是自噬上游分子，在自噬的启动过程中发挥了关键作用，可以作为自噬的标志蛋白[8]。LC3-II与自噬体膜延长、闭合及自噬小体的形成有密切关系，是自噬的另一标志性分子[9]。实验结果显示，与平原对照组相比，小鼠皮层组织Beclin-1及LC3-II分别经过1 d、3 d、7 d、14 d的高原低氧处理后均呈持续性高表达，提示高原低氧环境可大量激活皮层神经元自噬的发生，且呈时间非依赖性。

进一步研究发现，作为调控机体氧稳态的关键分子，HIF-1α在不同时长的高原低氧处理后也表现为持续性高表达，提示6000 m海拔的高原低氧环境可明显降低小鼠皮层组织的氧含量，从而导致转录调控因子HIF-1α的激活。已有文献报道，HIF-1α可以调控低氧条件下自噬的发生[10-11]，所以我们推测HIF-1α也可能是高原低氧环境下自噬激活重要的调控分子。

Hoechst 33342是一种可以穿透细胞膜的亲DNA荧光燃料，常用于细胞凋亡的检测。通过该染色，我们发现不同时长的高原低氧处理也明显增加了小鼠皮层神经元的凋亡率，提示高原低氧环境可以引起神经元凋亡的发生，与Maiti等的研究结果一致[1,12]。

至此，我们的实验结果表明，不同时长的高原低氧处理可明显上调氧敏感的转录调控因子HIF-1α的表达，激活自噬的发生，导致神经元发生凋亡。所以我们推测，高原低氧环境下自噬的大量激活加重了皮层神经元的损伤，最终导致神经元发生凋亡，是高原性脑损害发生的重要分子病理机制，而HIF-1α在该过程中发挥了自噬激活调控的重要作用。然而，在高原低氧环境下，自噬在神经元损伤中的确切作用及相关的分子调控机制仍不明确，有待进一步研究。

1ZHOU B, LI M, CAO X, et al. Phenylethanoid glycosides of Pedicularis muscicola Maxim ameliorate high altitude-induced memory impairment [J/OL]. Physiol Behav, 2016, 157: 39-46. doi: 10.1016/j.physbeh.2016.01.037.

2CHEN G, KE Z, XU M, et al. Autophagy is a protective response to ethanol neurotoxicity [J]. Autophagy, 2014,8(11): 1577-1589.

3丁培炎, 王冬, 赫曼, 等. 短期禁食诱导自噬对大鼠脑缺血损伤的保护作用 [J]. 中华神经外科疾病研究杂志, 2013,12(3): 201-204.

4WANG P, GUAN Y F, DU H, et al. Induction of autophagy contributes to the neuroprotection of nicotinamide phosphoribosyltransferase in cerebral ischemia [J]. Autophagy, 2012, 8(1): 77-87.

5BAI X, LIU S, YUAN L, et al. Hydrogen-rich saline mediates neuroprotection through the regulation of endoplasmic reticulum stress and autophagy under hypoxia-ischemia neonatal brain injury in mice [J/OL]. Brain Res, 2016, 1646: 410-417. doi: 10.1016/j.brainres. 2016. 06.020.

6WILSON M H, WRIGHT A, IMRAY C H. Intracranial pressure at altitude [J]. High Alt Med Biol, 2014, 15(2): 123-132.

7CHEN S J, YANG J F, KONG F P, et al. Overactivation of corticotropin-releasing factor receptor type 1 and aquaporin-4 by hypoxia induces cerebral edema [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2014, 111(36): 13199-13204.

8KANG R, ZEH H J, LOTZE M T, et al. The Beclin 1 network regulates autophagy and apoptosis [J]. Cell Death Differ, 2011, 18(4): 571-580.

9ASHRAFI G, SCHWARZ T. The pathways of mitophagy for quality control and clearance of mitochondria [J]. Cell Death Differ, 2013, 20(1): 31-42.

10GUI L, LIU B, LV G. Hypoxia induces autophagy in cardiomyocytes via a hypoxia-inducible factor 1-dependent mechanism [J]. Exp Ther Med, 2016, 11(6): 2233-2239.

11WU J, LEI Z, YU J. Hypoxia induces autophagy in human vascular endothelial cells in a hypoxia-inducible factor 1dependent manner [J]. Mol Med Rep, 2015, 11(4): 2677-2682.

12MAITI P, SINGH S B, MALLICK B, et al. High altitude memory impairment is due to neuronal apoptosis in hippocampus, cortex and striatum [J]. J Chem Neuroanat, 2008, 36(3-4): 227-238.

Correlationbetweenneuronalautophagyandapoptosisinmousecortexafterhigh-altitudehypoxiatreatment

MAWenke,DAIShuhui,YANGYuefan,LUOPeng,FEIZhou

DepartmentofNeurosurgery,XijingHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi'an710032, China

ObjectiveEffect of high-altitude (6000 m) hypoxia exposure for different duration on neuronal autophagy and apoptosis in mouse cortex was investigated, and the correlation between them was discussed.MethodsForty C57BL/6 mice were randomly divided into five groups: control group, and 1 d, 3 d, 7 d, 14 d high-altitude hypoxia exposure groups. High-altitude hypoxia circumstances (6000 m) was mimicked by hypobaric oxygen chamber. Then all the experimental groups were subjected to high-altitude hypoxia treatment for different durations, whereas the control group was kept only outside the chamber. Expressions of hypoxia-inducible factor 1α (HIF-1α) and autophagy marker proteins-Bcelin-1 and microtubule-associated protein 1 light 3-II (LC3-II) were detected by Western Blot. Hoechst 33342 staining was used to observe the neuronal apoptosis in mouse cortex.ResultsCompared with control group, the expressions of HIF-1α, Beclin-1 and LC3-II were significantly increased after high-altitude hypoxia exposure for different time. Meanwhile, neuronal apoptosis rates in mouse cortex were also increased after high-altitude hypoxia treatment.ConclusionActivation of autophagy may lead to neuronal apoptosis in mouse cortex after high-altitude hypoxia exposure and HIF-1α may play a regulatory role in this process.

High-altitude hypoxia; Neurons; Autophagy; Apoptosis

1671-2897(2017)16-317-04

R 651

A

国家自然科学基金重点项目资助项目(81430043)

马文科，硕士研究生，E-mail: mwkcqmu@163.com

*通讯作者：费舟，教授、主任医师，博士生导师，E-mail:feizhou@fmmu.edu.cn

2016-08-16；

2016-10-19)