大黄素甲醚对颅脑损伤大鼠NSE和GFAP表达的影响

李长栋 荔志云

(兰州军区兰州总医院神经外科, 甘肃 兰州 730050)

·论著·

大黄素甲醚对颅脑损伤大鼠NSE和GFAP表达的影响

李长栋 荔志云*

(兰州军区兰州总医院神经外科, 甘肃 兰州 730050)

目的观察大黄素甲醚对创伤性脑损伤大鼠人脐带间充质干细胞 (hUC-MSCs)移植后神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达的影响。方法将40只 2～3个月龄，体重200～250 g清洁级Wistar大鼠随机分为对照组(10只)、颅脑外伤组(10只)、脐带间充质干细胞移植组(10只)、脐带间充质干细胞移植(hUC-MSCs)+大黄素甲醚组(10只)。免疫组织化学法检测神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。结果与模型组比较，hUC-MSCs移植组、联合组大鼠脑组织中神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达增强，联合组表达更为显著。结论大黄素甲醚可通过诱导hUC-MSCs表达神经元NSE、GFAP，发挥其对TBI后神经细胞的保护作用。

人脐带间充质干细胞; 移植; 创伤性颅脑损伤; 大黄素甲醚; 神经性分化

脑外伤(traumatic brain injury, TBI)是头部受到暴力所造成的损伤，其发生率仅次于四肢伤，在死亡伤员中占第一位，是死亡率最高的部位伤，一直是创伤救治的重点和难点。重型颅脑损伤所导致的重度残疾和植物生存状态是困扰临床医师和科研工作者的难题[1]。

作为一种治疗创伤性颅脑损伤的新方法，近年来干细胞移植治疗颅脑损伤得到了学者的共识。间充质干细胞 (mesenchymal stem cells, MSCs)是来源于中胚层具有自我复制更新和多向分化的成体多能干细胞[2]。2003年Romanov等从人的脐带中分离出间充质干细胞，称为人脐带间充质干细胞(human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells, hUC-MSCs)[3]。通过深入研究，发现hUC-MSCs能分化成多种组织细胞，具有来源广泛，组织排异性低等优点[4]，是用于干细胞移植和再生组织工程领域的优质材料，临床应用前景非常广阔[5]。大黄素甲醚(physcion)为大黄中有效成分之一。大量文献报道，大黄素甲醚具有皮层神经元神经营养的作用[6]，抗神经细胞凋亡的作用[7]，抗炎性因子和抗氧化的作用[8]等。本实验研究运用免疫组化法，从脑组织神经元特异性蛋白的表达变化方面，观察大黄素甲醚联合hUC-MSCs移植对TBI后脑组织的保护作用，为研究一种既能被临床广泛应用，同时又具备诱导分化hUC-MSCs的药物，为治疗TBI提供理论依据。

材料与方法

一、实验动物

Wistar大鼠体质量200～250 g，2～3个月龄，雌雄不限，由兰州军区兰州总医院实验动物中心提供。

二、主要仪器和试剂

人脐带间充质干细胞(兰州军区兰州总医院血液病干细胞治疗中心培养)；低温高速台式离心机(UNIVERSAL116型，德国Hetaeus公司)：倒置相差显微镜(CKX41-A32PH型，日本Olympus公司)；细胞培养箱(NU-2700E型，德国NUAIR公司)；洁净工作台(SW-CJ-2FD型，苏州洁净化设备有限公司)；微量移液器(大龙医疗设备上海有限公司)：水欲摇床(SBD50-1.610型，Heto公司)；恒温循环器(CBN8-30型，Heto公司)；电子天平(AG-135型，瑞士梅特勒公司)；流式细胞检测仪(E0675型，美国FACSCALIBUR公司)；正置万能显微镜[20050929 (ND-11D)，日本Olympus公司]；多聚酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)扩增仪(Waltham, Massachusetts公司)，逆转录试剂盒(BioRad公司)。

三、脐带间充质干细胞的培养、鉴定

本实验模仿齐凯[9]在《人脐带来源间充质干细胞分离培养方法的优化》这篇文章中的方法进行了脐带间充质干细胞的培养、分离和纯化。取对数期P3代细胞，0.25%胰蛋白酶消化，配制成浓度为10×106/mL的细胞悬液，每个Eppendorf管加100 μL的细胞悬液，每种抗体设置2个复管。分别加入20 μL异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)-CD44、PE-CD45、PE-CD34，对照管分别加入等量相对应的FITC-IgG1和PE-IgG1，冰上避光孵育30 min，磷酸盐缓冲液(phosphate buffered solution, PBS)洗涤2次，250 g离心5 min，重新制备细胞悬液，经400目细胞筛过6滤，流式细胞仪(FACSCalibur)上机检测，荧光激活细胞分离法(fluorescence activated cell sorting, FACS)分析，记数10细胞，Cell Quest软件分析结果。

四、TBI动物模型的建立与实验步骤

将40只大鼠随机分为四组即对照组(10只)、TBI组(10只)、hUC-MSCs移植组(10只)、hUC-MSCs移植+大黄素甲醚组(10只)。TBI组、hUC-MSCs移植组、联合组共30只大鼠制备TBI模型，用10%水合氯醛按3 mL/kg剂量注射至大鼠腹腔中麻醉成功后，采用改良的Feeney法建立自由落体撞击模型造成大鼠闭合性颅脑损伤,致伤后大鼠出现四肢抽搐，呼吸暂停数秒，伤后昏迷2～10 h说明致伤成功。在制模结束后24 h将hUC-MSCs(已经 DAPI标记)2.0×106个细胞悬液0.5 mL通过大鼠尾静脉植入。 hUC-MSCs移植+大黄素甲醚组大鼠在移植细胞2～4 h开始予大黄素甲醚干预，用药剂量40 mg/kg·d灌胃，共用药2 w。

五、取材与处理

在模型制备后48 h、14 d、21 d，分别取TBI组及正常大鼠脑组织，常规HE染色镜下观察记录大体病理改变。hUC-MSCs移植组、联合组大鼠在细胞移植的21 d断头取脑备用。对照组和TBI组自前囟处开始作冠状位切片，至海马结构行HE染色；hUC-MSCs移植组、联合组同样方法切片至海马结构，每个脑标本选取位置相同的非连续层面5处，每一层面连续切片3张，用于抗体 NSE和抗体GFAP单染，片厚均为 5 μm。

六、免疫组织化学法检测神经元特异性烯醇化酶(neuron specific enolase, NSE)、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)

石蜡包埋，切片，脱蜡和水化，枸橼酸盐缓冲液(pH=6.0)电炉加热修复。按免疫组化试剂盒说明操作，室温下孵20 min后再滴加链酶亲和素-过氧化物酶；二氨基联苯胺显色，苏木素轻度复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。于显微镜下观察大鼠损伤脑组织 NSE及GFAP表达。每张切片随机选取损伤侧皮层5个视野，用图像分析系统Image2Proplus 6.0进行图像采集(显微镜×200倍)。观察每个视野表达阳性物质的神经元细胞数目，测定阳性表达的面积密度和平均光密度，计算整合光密度值(integral optical density, IOD)。阳性反应越大表示IOD值越大，反应越强。反之阳性反应越小，反应越弱表示IOD值越小。本次试验中NSE及GFAP阳性均表达呈棕褐色。

七、统计学处理

结 果

一、TBI大鼠脑组织病理变化

大体观察：对照组大鼠脑组织未见异常，TBI模型组大鼠脑组织可见脑皮层组织局部损伤(图1、2)；光镜观察：TBI组脑组织病理变化以左侧为主，病变主要集中在皮质部位；皮质固有细胞层次混乱，组织结构疏松，呈筛网状改变；各区域均存在神经元细胞数量减少伴炎性细胞浸润，周围组织水肿，残存神经元细胞中有散在的核固缩、核碎裂、凋亡小体形成，右侧脑组织病理变化不大。

图1 大鼠脑组织造模后48 h大体标本观察
Fig 1 Observation of rat brain tissues at 48 h after modeling

图2 造模后第14天大鼠断头取脑并行病理切片镜下观察，脑皮层受损伤病理学改变(HE染色, ×40)
Fig 2 At 14 d after modeling the rats were decapitated and examined by microscope (HE, ×40)

二、hUC-MSCs流式细胞学检测

hUC-MSCs流式细胞学检测细胞表面抗原发现，MSC的标志抗原CD45表达阳性，白细胞标志抗原CD44和造血前体细胞标志抗原CD34均表达阴性。证实该细胞为脐带间充质干细胞(图3A～C)。

三、免疫组织法分析NSE、GFAP的表达

在正置万能显微镜下观察，NSE、GFAP表达的阳性细胞呈棕褐色。镜下观察hUC-MSCs主要分布于左侧大脑皮质、海马等部位并分化为神经细胞，表达NSE、GFAP；联合组标本中hUC-MSCs的数量更多，分布范围更广，NSE、GFAP的表达更显著，正常对照组和TBI模型组中NSE、GFAP的表达较少(见图4和表1)。

图3 hUC-MSCs表达CD44纯度可达99%以上，不表达造血干细胞表型CD34和CD45
Fig 3 hUC-MSCs did not express the hematopoietic stem cell phenotype CD34 or CD45 and expression purity of CD44 was more than 99%.
A: The expression of CD44 antigen was negative in MSC; B: All of the CD34 markers of hematopoietic precursor cells were negative; C: MSC antigen positive expression of CD45.

CroupnNSEpositiveexpressionGFAPpositiveexpression Control616．91±1．4116．87±1．08 TheTBImodel616．32±1．34a16．93±1．62a hUC⁃MSCstransplant620．95±2．18b21．17±2．09b PHN+hUC⁃MSCstransplant625．82±1．72c30．29±2．48c

aPlt;0.01,vscontrol group;bPlt;0.01,vsTBI model group;cPlt;0.01,vshUC-MSCs transplantation group (PHN: Physcion).

图4 镜下观察hUC-MSCs主要分布于左侧大脑皮质、海马等部位并分化为神经细胞，表达NSE、GFAP
Fig 4 Microscopic observation of hUC-MSCs mainly distributed in the left cerebral cortex and hippocampus and differentiated into nerve cells
A: Control group; B: TBI group; C: hUC-MSCs group; D: hUC-MSCs transplantation+physcion group.

讨 论

TBI后大鼠脑组织的皮层神经元发生了继发性损伤、凋亡，相对应的神经元的功能也随之丧失。目前利用干细胞移植治疗颅脑损伤是一种比较前沿的治疗方法。安雅臣等[10]证实，hUC-MSCs移植后能明显减轻神经系统的功能损害。近年来，相关hUC-MSCs移植治疗脑损伤的动物实验积极开展，但研究发现移植到损伤大鼠脑组织中的hUC-MSCs神经元分化率较低，是妨碍临床中进行细胞移植治疗TBI的主要问题，因此，需要寻找一种不但临床应用广泛而且具有诱导hUC-MSCs神经分化能力的药物，以便更加有效地治疗TBI。

大黄是一味应用广泛的传统中药，也是我省四大名贵中草药之一。主要药理作用包括：致泻作用，保肝作用，止血作用，利尿作用，抗炎作用，抑制细胞凋亡等[11-14]。大黄素甲醚(physcion)为大黄中有效成分之一。大黄素甲醚具有皮层神经元神经营养作用[15]，抗神经细胞凋亡作用[16]，抗炎性因子和抗氧化作用[17]等。近些年来有关中药诱导hUC-MSCs向神经细胞分化的研究取得了重大的进展，例如使用黄芪、七叶皂苷钠等，并检测到诱导后hUC-MSCs可以表达 NSE、GFAP等多种神经细胞的特异性标志物[18]。本研究发现hUC-MSCs经大黄素甲醚诱导后可表达神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)且表达增强，提示大黄素甲醚具有促进hUC-MSCs分化和增殖的作用。

综上所述，本研究证实了大黄素甲醚可通过诱导hUC-MSCs表达神经元NSE、GFAP，发挥其对TBI后神经细胞的保护作用。

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EffectsofphysciononexpressionofNSEandGFAPinratswithcerebralinjury

LIChangdong,LIZhiyun

DepartmentofNeurosurgery,GeneralHospitalofLanzhouMilitaryCommand,Lanzhou730050, China

ObjectiveEffects of physcion on expressions of neuron specific enolase (NSE) and glial fibrillary acidic protein (GFAP) after transplantation of human umbilical cord mesenchymal stem cells (hUC-MSCs) in rats with traumatic brain injury were studied.MethodsA total of 40 clean Wistar rats (2～3 months, weighing 200～250 g) were divided randomly into control group (10 rats), TBI group (10 rats), hUC-MSCs group (10 rats), and hUC-MSCs transplantation+physcion group (10 rats). Expressions of NSE and GFAP were detected by immunohistochemical assay.ResultsCompared with TBI model group, the expressions of NSE and GFAP in hUC-MSCs group and hUC-MSCs transplantation+physcion group were significantly increased, with the hUC-MSCs transplantation+physcion group the most significant.ConclusionPhyscion can induce the expression of NSE and GFAP by hUC-MSCs, and exert its protective effect on the neurons after TBI.

hUC-MSCs; Transplantation; Traumatic brain injury; Physcion; Neurogenic differentiation

1671-2897(2017)16-321-04

R 651

A

甘肃省科技重大专项课题基金资助项目(1102FKDA005)；后勤科研计划课题基金资助项目(CLZ12J006)

李长栋，硕士研究生，E-mail:13919932236@163.com

*通讯作者：荔志云，教授，硕士生导师，E-mail:lizhiyun456@l63.com

2016-08-28；

2017-06-05)